核酸探针技术.pdf

核酸探针技术 化学及生物学意义上的探针(probe)，是指与特定的靶分子发生特异性相互作 用，并可被特殊的方法探知的分子。抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因 子-受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。 核酸探针技术原理是碱基配对。互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过 程称为核酸杂交。核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其 互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的 测。每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出 探针，用于疾病的诊断等研究。 (一) 核酸探针的种类 1.按来源及性质划分 可将核酸探针分为基因组DNA 探针、cDNA 探针、RNA 探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。 作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA 探针和cDNA 探针。其中，前者应用 最为广泛，它的制备可通过酶切或聚合酶链反应(PCR)从基因组中获得特异的 DNA 后将其克隆到质粒或噬菌体载体中，随着质粒的复制或噬菌体的增殖而获 得大量高纯度的DNA 探针。将 RNA 进行反转录，所获得的产物即为cDNA 。 cDNA 探针适用于RNA 病毒的 测。cDNA 探针序列也可克隆到质粒或噬菌体 中，以便大量制备。 将信息RNA(mRNA)标记也可作为核酸分子杂交的探针。但由于来源极不方便， 且RNA 极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此应用较 。 用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核酸杂交探针应用十分广泛，可根据需要随心 所欲合成相应的序列，可合成仅有几十个bp 的探针序列，对于 测点突变和小 段碱基的缺失或插入尤为适用 2.按标记物划分 有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。放射性标记探 针用放射性同位素做为标记物。放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛 的探针标记物。常用的同位素有32P、3H、35S 。其中，以32P 应用最普遍。放 射性标记的优点是灵敏度高，可以 测到Pg 级；缺点是易造成放射性污染，同 位素半衰期短、不稳定、成本高等。因此，放射性标记的探针不能实现商品化。 目前，许多实验室都致力于发展非放射性标记的探针。 目前应用较多的非放射性标记物是生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin) 。二者都 是半抗原。生物素是一种小分子水溶性维生素，对亲和素有独特的亲和力，两者 能形成稳定的复合物，通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、 荧光素等)进行 测。地高辛是一种类固醇半抗原分子，可利用其抗体进行免疫 测，原理类似于生物素的 测。地高辛标记核酸探针的 测灵敏度可与放射性 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 同位素标记的相当，而特异性优于生物素标记，其应用日趋广泛。 (二) 核酸探针的标记 1.放射性同位素标记法 常将放射性同位素如 32 P 连接到某种脱氧核糖核苷三 磷酸(dNTP)上做为标记物，然后通过切口平移法标记探针。 切口平移法(nick translation) 是利用大肠杆菌 DNA 聚合酶 I (E.coli DNA polymerase I) 的多种酶促活性将标记的dNTP 掺入到 形成的DNA 链中去，形 成均匀标记的高比活DNA 探针。其操作方法如下： (1) 取1?g DNA 溶于 量无菌双蒸水中，加入5?l 距离大约10 切口平移缓冲液