酿酒酵母附加型分泌表达载体pYES2_CT_factor的构建与鉴定.pdf

中国生物工程杂志 　Ch ina B iotechno logy, 2009 , 29 ( 12) : 49 ～53 一种酿酒酵母附加型分泌表达载体 α pY ES2 / CT / factor 的构建及鉴定 胡亚冬 1, 2 　姚冬生2 ( 1 广州科仁生物工程有限公司　广州 　510600) 　2 暨南大学微生物技术研究所 　广州 　510632) α (α ) 摘要 　以 p P IC9 为模板 ,通过 PCR 扩增获得酿酒酵母的 交配因子 factor ,并克隆至酿酒酵 α 母胞内表达载体 p YES2 / CT 中 , 构建了一种新型酿酒酵母附加型分泌表达载体 p YES2 / CT/ ( α) ( ) α α factor p YC 。再将甘露聚糖酶基因 m anna se, m an 通过酶切 、连接克隆至 p YC 的 factor的下 α α α 游 ,构建了 p YC m an 重组载体检验 p YC 的分泌性能和稳定性 。结果显示 factor可引导甘露 聚糖酶基因在胞外分泌表达 ,在曲利本兰培养基上形成明显的水解圈 ,进一步分析重组菌胞外和 α α 胞内酶活 ,结果显示对照 INV Sc1 /p YC 的两种酶活都未检测到 ,而 INV Sc1 /p YC m an 具有明显 α 的胞外酶活 ,未检测到胞内酶活 ,说明构建的 p YC 具有良好的分泌性能 ;稳定性实验表明重组质 粒连续培养 150 h仍具有良好的稳定性 。 关键词 　酿酒酵母 　信号肽 　分泌表达 中图分类号 　Q782 ( ) 　　酿酒酵母 S accha rom y ces cerevis iae 是一种最简单 好的外源蛋白表达途径 。 的单细胞真核生物 ,但和其他复杂真核生物一样拥有 　　目前 常 用 的商 用 酿 酒 酵 母 表 达 载 体 主 要 如 很多细胞器结构 ,具有复杂的翻译后修饰功能 ,再加上 Invitrogen 公司的 p YES系列 、p YC 系列和 A TCC 的 YEP 易培养的特性 ,酿酒酵母被用作研究真核生物的模式 系列、pB T系列等 ,但这些载体全部为胞内表达载体 ,不 生物 ,它的遗传背景和生理特性也 日益清晰 。因其具 适应胞外分泌表达的需要 。而稳定 、分泌性能好的附 有翻译后修饰功能 , 自上世纪 80 年代 H itzem an [ 1 ]首次 加型表达载体是定向进化的重要工具 。因此 , 本研究 利用酿酒酵母表达人干扰素基因获得成功后 , 许多来 以酿酒酵母胞内表达载体 p YES2 / CT为构建基础 ,选择 源于真核生物的蛋白在酿酒酵母中获得活性表达 。酿 α α 来源于酿酒酵母的 交配因子即 fac