青蒿二烯功能模块与酵母底盘的适配性研究.pdfVIP

目 录 前 言1 第一章 文献综述1 1.1 概述1 1.2 底盘细胞中的萜类合成途径3 1.3 萜类物质异源合成中的影响因素5 1.3.1 酵母底盘细胞的改造5 1.3.2 外源功能模块的表达水平6 1.4 萜类物质异源合成中基因缺失菌株的应用10 1.5 本课题的研究意义和主要研究内容11 1.5.1 研究意义11 1.5.2 研究内容12 第二章 材料与方法13 2.1 实验材料13 2.1.1 工具酶和试剂13 2.1.2 主要溶液及试剂配制14 2.1.3 实验仪器15 2.1.4 PCR 引物16 2.1.5 质粒和菌株18 2.2 实验方法21 2.2.1 基因的扩增21 2.2.2 质粒的构建22 2.2.3 重组质粒的转化24 2.2.4 大肠杆菌质粒的提取24 2.2.5 质粒的酶切验证25 2.2.6 重组质粒阳性克隆的鉴定25 2.2.7 琼脂糖凝胶电泳26 2.2.8 普通DNA 产物纯化回收26 2.2.9 普通DNA 产物凝胶回收27 2.2.10 酵母质粒的提取27 2.2.11 酵母基因组的提取28 2.2.12 酿酒酵母的转化29 2.2.13 酿酒酵母人工细胞的发酵29 2.2.14 发酵产物的检测30 第三章 青蒿二烯功能模块与底盘细胞的适配31 3.1 引言31 3.2 酵母原始底盘中内源MEV 途径的改造31 3.3 外源功能模块与底盘细胞的适配34 3.4 功能酵母细胞的发酵过程研究37 3.5 小结39 第四章 青蒿二烯融合蛋白表达模块与底盘细胞的适配40 4.1 引言40 4.2 融合蛋白功能模块与底盘细胞的适配40 4.2.1 启动子强度对适配性的影响42 4.2.2 蛋白融合顺序对适配性的影响42 4.3 表达融合蛋白的功能酵母细胞的发酵过程研究43 4.4 小结44 第五章 青蒿二烯功能模块与基因缺失底盘细胞的适配46 5.1 引言46 5.2 已知功能基因缺失底盘中青蒿二烯的合成46 5.3 未知功能基因缺失底盘中青蒿二烯的合成50 5.4 高产青蒿二烯功能酵母细胞的发酵过程研究51 5.5 小结52 第六章 结论与展望53 6.1 结论53 6.2 展望54 参考文献55 发表论文和参加科研情况说明63 致 谢64 前 言 前 言 萜类化合物广泛应用于制药、香料、工业领域，利用合成生物学技术在微生 [1] 物中异源合成萜类物质的研究引起了广泛关注 ，研究者已成功构建了多种异源 [2-16] [3,5,15] 合成萜类物质的功能细胞 。Keasling 课题组 通过改造酿酒酵母底盘细胞