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鞘氨醇激酶-2 在原代鼠皮层神经元激活自噬介导缺血耐受 中文摘要 鞘氨醇激酶-2 在原代鼠皮层神经元激活自噬介导 缺血耐受 中文摘要 目的：本研究旨在探索鞘氨醇激酶-2 （SPK2 ）是否参与神经元异氟醚预适应激 活自噬，进而研究 SPK2 是否通过激活自噬而保护神经元缺血损伤，初步探索 SPK2 激活自噬的分子机制。 方法：采用体外培养小鼠原代皮层神经元，建立异氟醚预适应（Isoflurane preconditioning ，ISO ）和缺糖缺氧（oxygen glucose dripivation ，OGD ）模型。利用 siRNA 分别干扰原代皮层神经元SPK2 和Beclin 1 的表达，用慢病毒感染原代皮层神 经元实现SPK2 过表达。利用免疫荧光和Western blot 检测SPK2 感染率和蛋白表达； 检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1 的表达，应用溶酶体抑制剂氯化铵(NH Cl)检测自噬 4 流。利用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8) 、乳酸脱氢酶细胞毒性检测试 剂盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit)检测SPK2 对OGD/R 诱导神经元死亡的保护作用， 应用自噬抑制剂3- 甲基腺嘌呤(3-Methyladenine ，3-MA)检测自噬在SPK2 致神经元缺 血耐受中的作用。利用免疫共沉淀检测Beclin1 与Bcl-2 之间的相互作用。 结果：在原代皮层神经元中，ISO 增强 SPK2 和LC3 的免疫荧光。SPK2 siRNA 降低ISO 诱导的LC3II 上调，Beclin 1 siRNA 也抑制ISO 诱导的LC3II 上调。神经元 慢病毒过表达SPK2 使LC3II 表达增加，并增加自噬流量，过表达SPK2 对神经元的 OGD 模型具有保护作用，表现为改善神经元形态损伤，增加神经元细胞活力，降低 LDH 漏出率，而3-MA 取消了这种保护作用。过表达SPK2 后，Beclin 1 siRNA 抑制 过表达SPK2 诱导的LC3II 上调；过表达SPK2 后，Beclin 1 与Bcl-2 相互结合减少。 结论：神经元异氟醚预适应上调SPK2 并激活自噬。干扰SPK2 和Beclin 1 取消 预适应引起的自噬激活，而过表达SPK2 激活自噬，对神经元的缺血损伤具有保护作 用。SPK2 可能通过解离Beclin 1 与Bcl-2 ，促进Beclin 1 释放而诱导自噬。 关键词： SPK2；异氟醚；预适应；神经保护；自噬；原代皮层神经元 作 者：张彤彤 指导教师：盛瑞 副教授 I 英文摘要 鞘氨醇激酶-2 在原代鼠皮层神经元激活自噬介导缺血耐受 Sphingosine kinase-2 induced autophagy activation mediates ischemic tolerance in primary cortical neurons Abstract Aim: This study is aimed to determine whether SPK2 (Sphingosine kinase-2) is involved in isoflurane preconditioning induced autophagy activation in primary cultured neurons. We also examined whether