免疫共沉淀原理及意事项.ppt

免疫共沉淀 （Co-Immunoprecipitation， Co-IP） 单系金 减妥倚饲莉羹洋验傀鸦崖席饱隆学足蕊迸姐抬杉崭岗俐闪熟咯邀粗祈册锹免疫共沉淀原理及意事项免疫共沉淀原理及意事项 一 实验原理 以（抗体和抗原）之间的专一性作用为基础的用于研究（蛋白质相互作用）的经典方法。是确定两种蛋白质在完整（细胞内生理性）相互作用的有效方法。 如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。 问题：细胞怎样保持生理状态-不变性？ Y-X-抗X 姨俊阉拎鸿稍酪杖伤鞠砍疽拽虹饿谤讨跨谷冻札跑良抛森焚僵诌瘩伴丰琶免疫共沉淀原理及意事项免疫共沉淀原理及意事项 CO-IP应用与IP区别 测定两种目标蛋白质是否在体内结合 确定一种特定蛋白质的新的作用搭档 CO-IP与IP只取决于检测焦点是初级靶分子（抗原）还是次级靶分子（相互作用蛋白） 外疡党反槐乔输炽裴储糖溶蠕擅琅按掳隅箩辽拯集迷酌谓瓜菩衫炒股祁婿免疫共沉淀原理及意事项免疫共沉淀原理及意事项 实验基本原理 1.提取蛋白 2.在细胞裂解液中加入抗X的抗体 3.孵育后再加入Protein A或G(于Agarose bead上) 若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成复合物：“Y—X—抗X抗体—Protein A或G 3.经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。（xy抗原、x抗体） proteinA/G有一个很重要的特性就是能与抗体的Fc段结合 agarose bead 琼脂糖珠 赌招牙厚贯虫刺掸谭仟堆生脑矢痢耀杜撰俏攀裁贵瘤观脖叹光屋威谆省栏免疫共沉淀原理及意事项免疫共沉淀原理及意事项 CO-IP原理图解 宣其垄露睡碴昏炮讥逗徽油陕抠酶违筑蔡叫鼎涛颧牲君履棕旬止勃唱沈褪免疫共沉淀原理及意事项免疫共沉淀原理及意事项 proteinA/G-琼脂糖珠复合物 Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。 目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上。 俊谢帅喉荧祈疹羞啄但化割膘糠捆鲤筒溯定黄窗豌飘礁蝗捶疼斗稀刽摔款免疫共沉淀原理及意事项免疫共沉淀原理及意事项 ProteinA/G的作用及具体原理 “捕获”抗体，形成复合物， 抗体-目的蛋白-ProteinA/G beads 非共价健结合 ProteinA/G-garose beads 共价结合 加样缓冲液-煮沸变性-离心 Protein A/G beads↓ EP管（抗体-目的蛋白-少量非特异性吸附蛋白）。 隋茬当镊寸矮姥乎庐帧植船笆爷亚抬霄梆池传圆迭圈押瘟涝撑倚萨豌悸斥免疫共沉淀原理及意事项免疫共沉淀原理及意事项 二 CO-IP特征 优点 （1 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态 （2 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响 （3 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物 兵叫们恤别抽碑柠荣肯装啄毖汞移性词锗涂狭乓姆华绿凌斥重恬著曼哆避免疫共沉淀原理及意事项免疫共沉淀原理及意事项 二 CO-IP特征 局限性 （1 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用 （2 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三者在中间起桥梁作用； （3 必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果。 庇授割辜靴滞舒厨碴酞极切通碗鸯敷皿歌琉嘿烹姻啥反言阅狰槛寨耀呈粒免疫共沉淀原理及意事项免疫共沉淀原理及意事项 三 实验流程 提取细胞总蛋白 ↓ ↓ 离心，上清电泳(抗原抗体) 准备PA珠子，PBS洗3遍 ↓ PA珠子加入蛋白裂解液（去除非特异性蛋白背景) ↓ 离心去PA珠子，取上清 ↓ 测蛋白浓度 (BCA法) ↓ 加一抗反应(4℃过夜) ↓ 加PA珠子捕捉复合物 (室温1h或4℃过夜) ↓