端粒结合蛋白在煤焦沥青烟提取物致人支气管上皮细胞恶变中的作用-答辩幻灯.ppt

端粒结合蛋白在煤焦沥青烟提取物致人支气管上皮细胞恶变中的作用  硕士研究生： 李小龙导 师 ： 吴逸明 教 授 王 威 副教授 主要内容 引言 材料与方法 结果 结论 致谢 引言 煤焦沥青已被世界卫生组织确定为明确的人类致癌物，但其致癌机制尚不十分清楚。 研究已发现绝大部分肿瘤细胞的端粒缩短，端粒酶活性增强，保持端粒的稳定是防止细胞癌变的一个重要步骤。 端粒是真核细胞染色体末端非编码DNA重复序列和与之相连的端粒结合蛋白的功能性复合体，端粒过度消耗或者结构破坏导致其功能障碍可引起细胞发生癌变。 该课题组已发现中温煤焦沥青烟可致BEAS-2B细胞端粒DNA相对长度缩短、端粒酶活力增高、POT1与TRF1的mRNA及蛋白表达下调、TRF2的mRNA及蛋白表达上调。 该研究通过RNA干扰技术分别抑制POT1和hTERT基因表达来观察煤焦沥青烟染毒BEAS-2B细胞的端粒结合蛋白TRF1、TRF2、POT1和hTERT的mRNA表达与蛋白表达等，分析他们在细胞恶变中的作用。 材料与方法 永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B。 中温煤焦沥青烟 短发夹RNA（shRNA）表达载体 溶解250mg中温煤焦沥青烟提取物于二甲基亚砜(DMSO) 50ml中，使用时培养液稀释至1.88mg/ml染毒。 根据POT1和hTERT的mRNA序列分别设计和合成各6组shRNA质粒表达载体。 BASE-2B细胞以煤焦沥青组，DMSO溶剂对照组和空白对照组分别进行培养，培养至1代、10代、20代和30代时分别对细胞进行转染，转染后1 d、4 d、7 d时分别进行指标检测。 采用Realtime PCR检测端粒缩短情况； Realtime PCR检测POT1，TRF1 ，TRF2和hTERT的mRNA表达情况；Western Blot方法检测及验证POT1的蛋白及端粒酶表达情况。 采用SPSS 12.0统计软件对数据进行统计学分析，采用t 检验，LSD检验，方差分析，Pearson相关性分析等方法，检验水准α = 0.05(双侧)。 结果 荧光显微镜下的转染细胞 抑制POT1基因的表达可导致hTERT的mRNA表达水平下调，端粒DNA相对长度缩短，TRF1与TRF2的mRNA表达水平上调，且各指标之间存在相关性。 POT1干扰1代、10代、20代、30代各组细胞POT1mRNA表达量 注：*表示经LSD检验与各组1d，空白对照组及各P-NC组比较，P0.05；#表示与空白对照组及DMSO(P-NC)组比较， P0.05；▲表示与空白对照组及RNAi-Mate组比较，P0.05。 。 POT1实验组细胞POT1蛋白相对表达量 注：*表示经LSD检验分别与各T-NC组及正常对照组比较，P0.05。 POT1基因抑制后CTP组细胞的克隆形成率 抑制hTERT基因的表达表达可导致POT1、TRF2的mRNA表达水平均下调，端粒DNA相对长度缩短，TRF1的mRNA表达水平上调，且各指标之间存在相关性。 hTERT干扰1代、10代、20代、30代各组细胞TERTmRNA表达量 注：*表示经LSD检验与各组1d，P-NC组及空白对照组比较，P0.05；#表示与空白对照组及DMSO(P-NC)组比较， P0.05；▲表示与空白对照组及RNAi-Mate组比较，P0.05。 hTERT实验组细胞端粒酶相对表达量 TERT基因抑制后CTP组各组细胞的克隆形成率 结论 抑制POT1基因表达可促进CTP对BASE-2B细胞的恶变作用，提示抑制POT1表达后，降低了端粒的保护作用，激发了TRF1及TRF2基因的表达使端粒长度缩短，细胞核异常，端粒酶活力降低，细胞恶变加速。 抑制hTERT基因表达后可减弱CTP对BASE-2B细胞的恶变作用，提示抑制hTERT基因可启动端粒延长替代机制，从而延缓或减弱细胞恶变。 致谢 衷心感谢我的导师吴逸明教授在学习方面对我的严格要求、工作中的谆谆教诲和生活中的亲切关怀。 衷心感谢王威老师在生活和学术中给予的支持和帮助，他的学术风范，治学态度，厚德博学使我受益良多！ 感谢劳动卫生和环境卫生教研室和毒理学教研的所有教授、老师和实验室老师在科学选题和实验过程中给予我的帮助和指导。 感谢所有同学给予我的帮助和照顾。 谢谢！