8第八章基因工程下游技术课件.pptVIP

重组蛋白可在E.coli、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等体系中得到高效表达,其表达形式一般可分为: (1)细胞外的分泌表达; (2)细胞内可溶性表达; (3)细胞内不溶性表达,即产物以包涵体的形式存在。 因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同,采取不同的纯化工艺。例如,当重组蛋白以包涵体形式存在时,就需要对包涵体进行变性-复性处理。 四、基因工程产品的表达形式 2011-10-30 * 基因工程下游技术 1.细胞质表达 很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白介素-6、人γ-干扰素等，不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1～3.0μm的固体颗粒——包涵体。这些基因表达产物的一级结构(即氨基酸序列)虽然正确，而其立体结构是错误的，所以没有生物活性。因此，为获得天然状态的目标产物，必须在分离回收包涵体后，溶解包涵体并设法使其中的目标蛋白质恢复应有的天然构象和活性。 2011-10-30 * 基因工程下游技术 包涵体的形成：原核、酵母和真核生物由于异源和同源蛋白过表达所形成的致密的不溶性颗粒。包涵体的形成与过表达蛋白的内在性质（如分子量、折叠途径等）无直接关系。因为大肠杆菌胞质环境是一个还原性环境，所以含有较多二硫键的蛋白较容易错误折叠形成包涵体。相比之下，周质空间有利于二硫键的形成，但是包涵体的形成也会发生。包含体的产生有利有弊。 包涵体的性质：致密（几乎全部是过表达蛋白，杂质主要是细菌外膜蛋白，离心时一起沉降）；通常对蛋白酶降解不敏感（发酵升温至42℃可促进包涵体形成并进一步抑制蛋白酶）。 分离包涵体并复性蛋白质的操作步骤并不复杂，从破碎细胞开始，然后将细胞匀浆离心，回收包涵体后，加入变性剂溶解包涵体，使之成为可溶性伸展态，再除去变性剂使表达产物折叠恢复天然构象及活性。 2011-10-30 * 基因工程下游技术 包涵体的分离、溶解和复性 溶菌酶处理—高压匀浆（细胞破碎效率较重要） 离心（固-液相分离） 去污剂或/和低浓度尿素或盐酸胍洗涤，去可溶性蛋白和膜蛋白 高浓度尿素或盐酸胍溶解包涵体，可添加DTT打开二硫键 逐步透析或稀释去除变性剂 2011-10-30 * 基因工程下游技术 2．细胞外周质表达 在细胞外周质进行蛋白质表达有许多优越之处。 （1）在外周质只有4%的总细胞蛋白，这显然有利于目的蛋白的纯化 （2）外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在转移到外周质的过程中，信号肽在细胞内剪切更有可能产生目的蛋白的天然N-末端。 （3）此外，外周质中的蛋白质降解也少得多。 但是，蛋白质转运到细菌外周质是一个特别复杂和尚未完全明了的过程，信号肽的存在并不总能保证蛋白质有效地通过内膜。 2011-10-30 * 基因工程下游技术 3. 细胞外分泌表达 将蛋白质分泌到细胞外是人们最期望的一种策略。因为这样容易纯化目的蛋白质，减少细菌的蛋白酶对目的蛋白质的降解。 2011-10-30 * 基因工程下游技术 4. 融合蛋白表达 在E.coli中表达外源蛋白，尤其是真核蛋白时，蛋白质的稳定性是经常遇到的问题。最近几年，众多巧妙的蛋白质——融合系统的发展，为E.coli中高效表达和纯化重组蛋白提供了极大方便。 融合表达具有多方面的优点： 防止包涵体的形成 促进蛋白质的正确折叠 限制蛋白酶解和利于纯化 2011-10-30 * 基因工程下游技术 2011-10-30 基因工程下游技术 * 融合表达体系 谷胱甘肽S－转移酶（GST） 麦芽糖结合蛋白（MBP） 硫氧还蛋白（Trx） 融合蛋白中目的蛋白的回收 位点特异性裂解的方法：溴化氰(Met↓)、 羟胺(Asn↓Gly)等试剂或低pH(Asp↓Pro)来进行融合蛋白的化学裂解。 酶解：反应条件较温和，所用蛋白酶具有高度的特异性，如凝血酶、肠激酶、凝乳酶和胶原酶等。所有这些酶都具有较长的底物识别序列，从而降低了蛋白质中其他无关部位发生断裂的可能性。 五、实例：粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)下游生产工艺流程 菌种划板及扩菌 75L发酵罐扩菌诱导,流加补料 离心收集菌体 高压匀浆破菌，洗涤提取包涵体 溶解包涵体，Sephacryl S-200分子筛柱层析 复性 超滤浓缩，Q Sepharose Fast Flow离子交换柱层析 Superdex 75 Prep Grade分子筛柱层析 分装、冻干 2011-10-30 * 基因工程下游技术 六、外源基因表达产物的质量检测 工业化生产的重组蛋白必须经过严格的质量控制才能成为产品。重组蛋白的质量控制