ATP生物发光技术课件.pptVIP

* * ATP生物发光技术 ——楼俊辉 张炜 章建 刘星宇 L O G O 生物发光，即用荧光素酶基因标记细胞或DNA，直 接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为 。观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。 相比于传统（通过不同时间点宰杀实验动物而获得数据）的方法，对一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标（标记细胞及基因）的移动及变化，更可靠。 L O G O 一，技术原理 二，技术应用 三，技术优势 L O G O 一、技术原理 （1）标记原理 （2）光学原理 （3）实验过程 标记原理 哺乳动物生物发光，是将Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素（luciferin），即可在几分钟内生发光现象。 这种酶在ATP及氧气的存在条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。 （1）标记原理 L O G O 通过分子生物学克隆技术，将荧光素酶的基因插到预期观察的细胞的染色体内，通过单克隆细胞技术的筛选，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，将标记好的细胞注入小鼠体内。观测前需要注射荧光素酶的底物—荧光素。荧光素脂溶性非常好，很容易透过血脑屏障。 ■约一分钟后表达荧光素酶的细胞开始发光； ■十分钟后强度达到最高；在最高点持续约20～30分钟后开始衰落，约三小时后发光全部消失。■最好的检测时间是在注射后15到25分钟之间。 L O G O 每次荧光素酶催化反应只产生一个光子：IVIS （infrared videodata imaging system 红外视频数据成像系统成像系统） ★一个高度灵敏的制冷CCD相机 ——将光学信号转化为数字信号； ★特别设计的成像暗箱和成像软件 可——屏蔽宇宙射线在内的所有射线 ——观测、记录并分析这些信号 L O G O 光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，在偏红光区域，大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到（衍射）。在相同的深度情况下，检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系。软件为每一次使用提供一张图片作为数据结果，记录了发射出的光子数据。颜色体现了单位面积中发射光子的数量，信号强度高的为红色，低的为紫色。 （2）光学原理 L O G O ◆ 麻醉系统麻醉小鼠后放入成像暗箱平台 ◆ 软件控制平台的升降到一个合适的视野，自动开启照明灯拍摄第一次背景图。 ◆ 自动关闭照明灯，在没有外界光源的条件下拍摄由小鼠体内发出的光，即为生物发光成像。 ◆ 与第一次的背景图叠加后可以清楚的显示动物体内光源的位置，完成成像操作。 （3）实验步骤 L O G O 软件完成图像分析过程：使用者可以方便的选取感兴趣的区域进行测量和数据处理及保存工作。当选定需要测量的区域后，软件可以计算出此区域发出的光子数，获得实验数据。 L O G O 二、技术应用 （1）标记细胞 （2）标记病毒 （3）标记细菌 （4）基因表达和蛋白质的相互作用 （5）转基因动物模型 L O G O （1）标记细胞 ◆ 癌症与抗癌药物研究 直接快速地测量各种癌症模型中肿瘤的生长和转移，并可对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估。活体生物发光成像能够无创伤地定量检测小鼠整体的原位瘤、转移瘤及自发瘤。 通过给予肿瘤接种的小鼠不同的剂量，并不同的给药时间、不同的给药途径，观察抗肿瘤药物的最佳给药途径、给药剂量并给药时间，从而制定合适的剂型与服药时间。 L O G O （1）标记细胞 ◆ 癌症与抗癌药物研究 ●U251-HRE细胞：其中的荧光素酶基因表达受可诱导启动子的操控，低氧状态为其诱导条件。当肿瘤发展到300~500mg时，局部组织低氧（微环境），表达； ●组织切片也可以观察到生物发光，荧光素酶的体外活性保持时间比较短，约几十分钟； ●已商品化的肿瘤细胞株包括：前列腺癌，乳腺癌，子宫颈癌和结肠癌等细胞系模型。 L O G O （1）标记细胞 ◆ 免疫学与干细胞研究