蛋白诱导-LJ课件.pptVIP

实验四 基因的诱导表达与融合蛋白的纯化 实验目的 掌握基因诱导表达的原理与方法 掌握蛋白质纯化的基本原理 巩固蛋白质电泳的基本方法 一、基因表达系统 二、表达瓶颈 1、蛋白翻译后折叠、修饰； 2、蛋白翻译后易降解、形成包涵体； 3、蛋白分离纯化、复性； 4、基因表达调控。 三、表达方式 融合蛋白 1、基因融合：将两个或多个开放阅读框架按一定顺序连接在一起，表达产物是一个杂和蛋白，靶蛋白连接在运载蛋白（识别标签）的氨基端或羧基端。 2、应用潜力： 简化靶蛋白的标记与分离； 靶蛋白与信号肽连接，将靶蛋白分泌到特定细胞区； 保护靶蛋白免受宿主蛋白酶降解； 改善靶蛋白溶解性，防止形成包含体。 识别标签 β-半乳糖苷酶（lac-Z） 谷胱甘肽-S-转移酶（GST） 多聚组氨酸（poly-his） 人工7肽FLAG 四、表达体系选择 常用体系—大肠杆菌体系（菌株+载体） 依据： 蛋白大小（100 amino acid residue） 蛋白数量 蛋白活性要求（产生抗体、生物学研究、 结构研究） 六、实验原理 重组蛋白的表达方式与纯化方式是由表达载体决定的。 在原核表达系统，表达载体均携带一个条件表达的启动子，由这一启动子控制外源基因的表达。 在未经诱导的情况下，外源基因不表达，这就防止了外源基因产物对细菌正常生长的干扰。在细菌生长达到一定数量时再加入诱导剂诱导基因表达，可最大限度提高重组蛋白的产量。 重组蛋白的表达与诱导剂加入的时间和浓度相关。 本实验采用的pGEX 4T-1表达载体，外源基因与GST形成GST-融合蛋白。由于GST能特异性结合谷胱甘肽，因此在纯化时可利用偶联谷胱甘肽的琼脂糖凝胶进行亲和层析，纯化过程简便且产物纯度高。 八、影响外源蛋白表达的主要因素 细胞生长速率 细胞生长温度（20-37℃ ） 诱导剂浓度和诱导时间 ①首先进行小规模预实验确定最佳条件 ②大规模培养进行提取、纯化目的蛋白 九、操作步骤 （一）融合蛋白的诱导表达 1．接种2个单菌落（转化了空质粒pGEX-4T-1的BL21菌种及携带112的菌种）于5ml LB Amp+液体培养基，37℃振荡培养过夜。 2．将500μl过夜培养物与50ml Amp+LB混合，37℃振荡培养4小时。——放大培养 3．将培养物分成8管，每管5ml，按下表所示加入IPTG，30 ℃振荡培养4小时。 4. 每管菌液3000rpm离心5分钟，收集沉淀，弃上清。 5. 每管各加入200 μl 的上样缓冲液，振荡煮沸变性5分钟备用。 （二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1．安装电泳装置 2．配制12% 分离胶10ml： 4 0% Acr/Bis 3.0 ml 1.5 mol/L Tris pH 8.8 2.5 ml H2O 4.3 ml 10% SDS 0.1 ml 10% 过硫酸铵 0.1 ml TEMED 0.004 ml 小心滴加ddH2O覆盖于分离胶表面，静置 30min待凝胶凝结，弃去上层水。 4．电泳 (1)上样 20 ul (2)电泳 浓缩胶段：80 V/cm 分离胶段：120 V/cm 5．考马斯亮蓝染色：将电泳胶浸泡于考马斯亮蓝染色液中，室温放置10分钟。 6．脱色：将电泳胶从染色液中取出，浸泡于脱色液中，每隔20分钟换一次脱色液。三次后，脱色过夜。 8.选择最佳生长温度、诱导浓度、诱导时间； 进行500ml大规模培养—裂解细胞—纯化融合蛋白—应用 7.结果观察 * * 基因工程的下游技术 基因的诱导表达和重组蛋白的纯化 表达载体(含有表达元件) IPTG诱导启动子载体(tac/trc/lac-pUC,pTZ,pSK,pBluescript,pGEM) 表达宿主 T7噬菌体启动子载体(不依赖大肠杆菌RNAP,T7-lac) PL启动子载体(温度敏感) 原核(大肠杆菌-物美价廉、枯草芽孢杆菌) 真核（酿酒酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞） 人工标签 选择表达载体常用的