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人类免疫缺陷病毒抗体检测(ELISA)
1. 原理
在微孔条上预包被纯化基因工程人类免疫缺陷病毒I型和II型(HIV-1/HIV-2)抗原(合成肽或基因重组蛋白),采用双抗原夹心法检测血清或血浆中人类免疫缺陷病毒抗体。样品加入包被抗原反应孔,在随后的温育过程中,若样品中含特异抗体,则该抗体与包被抗原形成抗原抗体复合物被吸附到固相,再加入酶标记的HIV-1/HIV-2抗原,最终形成抗原-抗体-酶标抗原复合物,洗涤除去未结合的游离酶,加入显色剂后显色。
2. 标本采集
2.1 采集前病人准备:受检者应空腹
2.2 标本种类:血清或血浆
2.3 标本要求:采集病人静脉血2ml(可用EDTA抗凝),室温放置不超过4小时,分离血清备用。
3. 标本储存:2-8°C保存不应超过48小时,-20°C不应超过3个月,-70°C 长期保存,应避免反复冻融。
4. 标本运输:密封,室温运输。
5. 标本拒收标准:污染、标本量不足、严重溶血或脂血标本不宜作此项检测。
6. 试剂
6.1 试剂名称:人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒
6.2 试剂生产厂家:北京万泰生物工程有限公司。
6.3 包装规格:96Test/Kit
6.4 试剂盒组成:包被反应板,HIV酶标记物,阳性对照血清,阴性对照血清,浓缩洗涤液,底物A,底物B,终止液,封口膜,密封袋。
6.5 试剂储存条件及有效期:2-8°C避光保存,有效期6个月。
7. 仪器设备
7.1 仪器名称:自动酶标仪
7.2 仪器厂家:Rayto
7.3 仪器型号:RT-6100
8. 操作步骤
8.1 平衡:将试剂盒各组分取出,平衡至室温(18-25°C),微孔板开封后,余者及时以自封袋封存。
8.2 配液:浓缩洗涤液配制前充分摇匀(如有晶体应充分溶解),浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1:19稀释后使用。
8.3 编号:将微孔条固定于支架,按序编号。
8.4 加样:用加样器在微孔反应条板孔中加入样品100?l;空白孔不加任何液体;阴性对照孔和阳性对照孔,每孔分别加入阴阳对照各100?l,标好位置。对照应在所有标本加完以后再加,以保证阈值准确性。
8.5 温育(一):充分混匀,加上封板膜,置37℃温育60分钟。
8.6 洗涤(一):用洗涤液充分洗涤5次,洗涤完扣干(每次应保持30-60秒的浸泡时间)。
8.7 加酶:分别在每孔中加入酶标记物100?l,轻拍混匀。
8.8 温育(二):充分混匀,加上封板膜,置37℃温育30分钟。
8.9 洗涤(二):用洗涤液充分洗涤5次,洗涤完扣干(每次应保持30-60秒的浸泡时间)。
8.10 显色:每孔加入底物A、B各50?l,轻拍混匀,置37℃暗处30分钟。
8.11 终止:每孔加终止液50?l,混匀。
8.12 测定:用酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各孔OD值(用单波长测定时需设空白对照一孔,30分钟内完成测定,并记录结果)。
9. 结果判断与分析
9.1 临界值(C.O.)的计算:临界值=0.15+阴性对照平均OD值。
9.2 结果判定:样品OD值S/C.O=1者为阳性
样品OD值S/C.O1者为阴性
9.3 正常时,阴性对照OD值应=0.12,阳性对照OD值应=0.80,
阴性对照若小于0.08以0.08计算。
9.4 若阳性对照OD值超出正常范围或其孔间之差大于30%,应重复试验。
9.5 初次试验阳性者应重新取样进行双孔复试,按全国HIV检测管理规范的要求,须将血样或重新采血送HIV确认实验室做确认试验,确认报告阴性者,血可以发放使用;凡确认实验阳性和可疑者,血不能发放使用,统一送确认实验室处理。
10. 质量控制:每次测定均做双孔或以上复试;阴阳对照OD值应在要求范围内。
11. 参考范围:阴性
12. 临床意义:在血清中HIV抗体的存在表明可能有人类免疫缺陷病毒感染。
13. 操作性能:灵敏度、特异性高。
14. 方法局限性
14.1 只能用作HIV抗体检测的初筛试验。
14.2 样品显色深浅与样品中抗体的含量没有一定正相关。
15. 病危报警值的处理:初次试验阳性者应重新取样进行双孔复试,按全国HIV检测管理规范的要求,须将血样或重新采血送HIV确认实验室做确认试验;通知防保科和临床申请医生。
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