实验九 石蜡切片制作.ppt

石蜡制片的基本步骤 1.取材 2.杀死与固定 3.脱水 4.透明 5.浸蜡与包埋 6.切片 7.粘片与烤片 8.脱蜡与复水 9.染色 10.切片脱水、透明和封固 1.取材 1.1 材料来源及部位。 ①种类 ②部位 ③发育阶段 ④是观察横切面还是纵切面？ 1.2 取材原则： 动作：快，轻，用力均匀 体积合适 刀要锋利 2. 杀死与固定 目的---杀死各种酶，保持细胞的结构 固定液 固定时间 固定后的处理 最常用的固定液为FAA。固定时间不受限制，短则 数小时，长可延至数月或数年。 配方： 50％或70％酒精 90毫升 冰醋酸 5毫升 福尔马林 5毫升 柔软材料用50％酒精，坚硬材料用70％酒精配制。 卡诺氏(Carnoy’s)固定液：有极强的渗透力 固定根尖和花药只需40-60分钟，时间太长不好(不能超一天)。 固定后用95％酒精冲洗，在组织不能立即处理时，需转入70％酒精中保存。配法有两种： 固定组织时应注意： ①保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。 ②组织块不易过大过厚，厚度必须控制在0.3cm以内。 ③固定液必须有足够的量，一般大于组织20倍以上。 ④抽气：使固定液尽快渗入材料内部，并排除材料内气泡的干扰。 组织固定后的处理 ①冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。 ②材料经过固定后，需要保存下来以备利用，通常使用的保存剂是70%的酒精溶液，可以使一般的材料保存较长的时间而不至于变坏。 ③通常在冰箱中4℃存放。 3. 脱水 水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透明剂进入。 凡用酒精配制的固定液，一律用同浓度的酒清洗。 酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混。为了避免组织材料的急剧收缩，应按从低浓度到高浓度递增的顺序进行. 30%--50%---70%---85%---95%--100%--- 100% 每步30-60分钟左右。 要求及注意事项 保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净。 不同大小的组织块脱水时间不同。 不能过度脱水（过久使组织变脆、收缩） 在50%酒精中加入曙红，用于染色。 材料可以放在70％酒精中保存。 正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。 4.透明 纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。 常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各种透明剂均是石蜡的溶剂。 通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。 材料进入无水的透明剂中后，若透明剂变浑浊，说明材料中的水分未脱干净，必须回到前面一级无水的脱水剂中再次脱水（但是效果往往不好）。 透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及组织特性而定。 5.浸蜡与包埋 用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。 通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小时或者过夜，再先后移入熔化的石蜡液中浸渍几天。 浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。 石蜡的处理： 新蜡应溶一次，增加密度。 并用滤纸过滤去除杂质。 加5%～10%的蜂蜡,增加石蜡的韧性。 反复溶的旧蜡包埋效果更好。 程序：在溶蜡箱中进行，55-60℃，恒温。 浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯︰石蜡（1 ︰ 1）中1次，在石蜡中2次，每次1-3天左右。 包埋：在室温进行 6. 切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的梯形，粘于小木块上。 切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。 通常切片厚度为8～12微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。 7. 粘片与烤片 用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后操作中材料脱落。 在载玻片上涂抹粘片剂，再滴蒸馏水，放上蜡片，至于展片台上铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入42℃温箱中干燥。 常用的粘片剂为郝伯特(Haupt) 粘贴剂： 甲液：明胶 1克 蒸馏水 100毫升 甘油 15毫升 苯酚 2克 乙液：甲醛 4毫升 蒸馏水 100毫升 8. 脱蜡及复水 干燥后的切片需脱蜡及复水才能在水溶性染 液中进行染色。 用二甲苯脱蜡，再逐级经梯度酒精复水。 脱蜡（溶蜡）：将切片上的石蜡溶去。一般都用二甲苯溶脱