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左上：实时定量 PCR仪 右上：该仪的部 分工作原理 下：实验结果的 输出 DDPCR的原理是取无DNA污染的总RNA，分别加入三个锚引物，H-T11 -C、H-T11 -G和H-T11 -A，三个引物的11个T（胸苷）选择性地结合到mRNA的A（腺苷）尾上，在反转录酶的作用下，将所有的mRNA反转录成cDNA。再以这一含cDNA的反应液为模板，分别加入以上三个锚引物，和若干随机引物，如AAGCTTGATTGCC，AAGCTTCGACTGT等，PCR放大位于某一特定锚引物与随机引物相应序列的所有cDNA，反应体中加入α[33P]dATP或α[35S]dATP。把两个或两个以上细胞系或组织锚引物与随机引物相一致的PCR产物相邻上样于变性测序凝胶上，电泳，放射自显影，曝光。两个或两个以上细胞系或组织相同mRNA所反转录的cDNA在X片上会出现并列的显影条带，而不同mRNA所反转录的cDNA会出现独特的显影条带。 DDPCR电泳后的放射自显影图 目前RT-PCR（反转录PCR）技术使用得十分频繁，在判断、比较不同组别某一mRNA转录与否或转录多少等方面十分便捷，与Northern blot相比，程序简单、快，但灵敏度差些，重复性亦差些，对mRNA提取质量要求高。其原理是先用寡聚胸苷作为引物，反转录所有mRNA成cDNA，再用拟扩增片段两端的两段引物，PCR扩增该段cDNA。为校正样本RNA含量组间可能存在的误差，通常在同一试管内一并扩增β肌动蛋白的cDNA。上样电泳，并染色后，拍照，激光光密度计扫描定量，用β肌动蛋白校正拟扩增的基因片段灰度值，统计分析。此外，还有原位PCR等等由PCR演变而来的技术。下图是PCR设备和PCR结果的电泳检测。 （十四）DNA的定点诱变 目的：主要在于观察定点诱变后DNA表达蛋白的结构与功能的变化。 采用酶和化学试剂切割DNA，或合成含有缺失或插入的引物，PCR放大，再通过连接、转化等手段，造成目的DNA的缺失或插入。 （十五）克隆化基因在大肠杆菌和哺乳动物培养细胞中表达 将目的基因重组入相应的，分别可以在原核或真核细胞中进行表达的载体，采用物理或化学方法将重组后的载体导入真核或原核细胞，使目的基因得以表达出所需的蛋白，用以研究或作为产业生产。 （十六）克隆化基因所表达蛋白质的检测和分析 此项实验包括两个部分。其一，单克隆抗体的制备和纯化，即分离出前面介绍表达出的蛋白，例如采用电泳分离方法，以此蛋白作为抗原,激发兔免疫系统产生单抗，再予以纯化。其二，应用此抗体检测靶组织相应蛋白（抗原）是否存在，及其含量。这类方法主要包括免疫沉淀法、固相放射免疫测定（RIA）法和固定化蛋白质的免疫学测定（Western blot法）。 其他比较热门的技术： 1．基因类 （1）cDNA Array 和 Micro Array （2）基因全序列cDNA库筛选 （3）RACE PCR 2．蛋白类 （1）Western blot （2）ELISA （3）免疫组织化学 （4）单克隆抗体制备技术 （5）双向等电聚焦凝胶电泳 （6）蛋白芯片技术 3．基因功能类 （1）报道基因 （2）基因功能检测 （3）Footprint （4）凝胶阻滞分析 三．用分子生物学方法研究中医的现状 * 第六章 第八节 分子生物学方法 及其在中医研究中应用 一．中医药实验研究为什么要采用分子生物学技术 1．一些不同的认识 2．中医药实验研究采用分子生物学技术的必要性 （1）振兴中医的重要机遇 分子生物学、细胞生物学以其实验条件便于控制、实验稳定、重复性好、实验周期短、仪器试剂（包括各类试剂盒）发展快，手段丰富、国际研究普遍（使新方法、新技术层出不穷）、研究积累快、参考文献丰富，可以观察人体的不同组织的细胞、分子（这又强于动物实验），给应用该方法技术研究创造了绝佳的条件。 业已进行的研究揭示和开拓出生命科学广大的未知领域。 由于分子生物学新兴、发展快，给国内外、中西医创造了同等的发展和应用的机会，再次使中、西医有可能站到同一起跑线上。抓住这个千载难逢的机会，充分利用它、驾御它，必将给中医学注入强大的生命。 （2）保持中医药优势的需要 几千年来，中医在运用天然药物方面积累了丰富的经验。比如其中一些天然动植物药物的粗制品，比如水蛭素、蛇毒抗栓酶类粗制品已经作为我国的传统医药产业。但是当国外采用了分子生物学技术和生物工程，生产出水蛭素、类凝血酶素，既降低了成本，又提高了质量的稳定性。反销我国和国际市场，对我国传统医药产业形成了巨大竞争。有识之士开始呼吁不能坐视祖国医学优秀遗产的优势失去，主张抓紧采用分子生物学研究天然中药的有效成分，开发新药，不然势将失去优势。通过几十年的研究，中药所面临的问题已经暴露得十分清楚，比如中药材的质