PCR常见问题、原因及其对策.ppt

PCR技术常见问题、原因分析及其对策 淮北师范大学生命科学学院 朱秀云 内容 PCR技术的简介 什么是PCR? PCR: Polymerase chain reaction，即聚合酶链反应 是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术 PCR技术的简介 PCR技术的发展历史 关于PCR 的文章首次由美国科学Kary Mullis等 人在 《Science》杂志上发表 1989 《Science》杂志报道了耐热性DNA多聚酶 Taq酶（生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐 热的DNA聚合酶 ）的发现,预示着分子时代的到 来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚 合酶命名为第一个“年度分子”。 1993 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。 PCR技术的简介 PCR原理的简介 PCR的扩增过程模拟体内DNA的天然复制过程，利用一种从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分离出的具有热稳定性的DNA 聚合酶，及碱基互补配对原则。通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的多次循环,最终使基因扩增形成特异区段的DNA带，实现DNA在体外的特异性扩增。 PCR技术的简介 PCR的常见问题、原因分析及对策 PCR常见问题 无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性 PCR的常见问题、原因分析及对策 PCR常见问题之一：无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无； PCR的常见问题、原因分析及对策 PCR常见问题之二：非特异性扩增 现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 PCR的常见问题、原因分析及对策 非特异性扩增 PCR的常见问题、原因分析及对策 PCR常见问题之三：拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 PCR的常见问题、原因分析及对策 拖尾 PCR的常见问题、原因分析及对策 PCR常见问题之四：假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况) 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染 对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 提高PCR反应特异性的策略 四种策略： 巢式PCR（Nest-PCR） 递减PCR（Touch Down PCR） 热启动PCR（HotStart PCR） 使用PCR增强剂 提高PCR反应特异性的策略 策略之一：巢式PCR（Nest-PCR） 提高PCR反应特异性的策略 策略之二：递减PCR（TouchDown PCR） 递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃。 特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。 递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析。 提高PCR反应特异性的策略 策略之三：热启动PCR （HotStart PCR） 热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度。 现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用。 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。 提高PCR反应特异性的策略 策略之四：使用PCR增强剂 甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。 其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。 增强剂浓度要适当 。 提高PCR反应特异性的策略 3 PCR技术简介 1 PCR常见问题、原因分析及对策 2 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~35轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 原因 对 策 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间 引物特异