114例HBsAg阳性孕妇及其新生儿PBMC 感染HBV的状况论文.docVIP

　　114例HBsAg阳性孕妇及其新生儿PBMC 感染HBV的状况论文 王效军 王素萍 李铁钢 冯永亮 【关键词】 外周血单个核细胞；乙型肝炎病毒；原位杂交 【摘要】 目的：了解HBsAg阳性孕妇及其新生儿PBMC HBV感染状况。方法：采用原位杂交(ISH)技术检测114例孕妇和新生儿PBMC涂片中HBV DNA。结果：114例HBsAg阳性孕妇及其新生儿PBMC HBV DNA的检出率分别为28.07%（32/114）和32.46%（37/114）；HBsAg阳性孕妇与其新生儿之间的PBMC HBV感染存在一致性（Kappa=0.52, P 0.01）。结论：证实HBsAg阳性孕妇与其新生儿之间的PBMC HBV感染存在一致性。 【关键词】外周血单个核细胞；乙型肝炎病毒；原位杂交 【Abstract】Objective：To observe the status of HBV infection in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from the HBsAgpositive mothers and their neonates. Methods：In situ hybridization (ISH) ear from 114 HBsAgpositive mothers and theirs neothers and their neonates ent of the HBV infection status betothers and their ne the mothers agrees their neononuclear cells; hepatitis B virus; in situ hybridization 乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）宫内感染是导致我国HBsAg慢性携带的重要原因，HBV宫内传播是HBV宫内感染的重要途径，其机制复杂多样。临床上乙肝疫苗（hepatitis B vaccine，HBVac）和乙肝免疫球蛋白（hepatitis B immune globulin，HBIG）的联合应用不能完全阻断HBV母胎之间的宫内传播（intrauterine transmission），有研究［1］证实在HBsAg阳性孕妇及其新生儿外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中均可检出HBV复制中间体（covalently closed circular, cccDNA）。HBV感染PBMC.freelin离心30 min；吸取单核细胞层于另一试管，加2 mL Hank，s 平衡盐溶液，1000 r/min离心10 min，再重复洗涤2次 ；洗涤后的细胞用30μLHank，s 溶液制成细胞悬液；取5～10μL涂于经APES（3氨丙基3乙氧基甲硅烷）防脱处理的载玻片上；70%乙醇固定，自然晾干，4 ℃保存备用。 1.2.2 HBV S基因探针的制备 （1） PCP10HBV DNA重组质粒DNA的提取： 吸取1.0～1.5 mL复苏的PCP10质粒培养液于1.5 mL离心管中，4 ℃下14000 r/min离心30 s；吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥；将细菌沉淀重悬于0.5 mLSTE，4 ℃下14000 r/min离心1 min；吸去上清，使细菌沉淀尽可能干燥；将细菌沉淀重悬于冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈震荡后加入200μL新配制的溶液Ⅱ（盖紧管口，快速颠倒5次，不要震荡），置于冰上3 min；加150 μL冰预冷的溶液Ⅲ（盖紧管口，将管倒置后温和地震荡10 s，之后将管置于冰上3～5 min），4 ℃下14000 r/min离心10 min，将上清转移至另一1.5 mL离心管中；加1倍上清体积的酚:氯仿(1∶1)，震荡混匀，4 ℃下14000 r/min离心2 min，将上清转移至另一1.5 mL离心管中；加2倍上清体积的95%乙醇，振摇混合，室温静置2 min，14000r/min离心10 min；小心吸去上清，离心管倒置于滤纸上，使所有液体尽量流出，再用滤纸除尽附于管壁的液滴；再加入70%乙醇1mL，4 ℃下14000 r/min离心5 min以洗涤DNA沉淀；再小心吸去上清，离心管倒置于滤纸上，使所有液体尽量流出，用滤纸除尽附于管壁的液滴，空气中干燥10 min，30μLTE缓冲液溶解，-20 ℃保存。（2） HBV S基因双链DNA裸探针的制备及标记：采用PCR法扩增HBV S基因，引物选自HBV S基因启动子和终止子附近的保守序列［3］（189～689 nt），由上海生工生物工程技术有限公司合成，扩增片断长度为500 bp，引物序列为：