世界上最完善详细的神经元原代培养完全黄金版.doc

世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版 [精华] 序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why.为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（/bbs/post/view?bid=156idty=3） 本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。1.材料选择。一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。我强烈不建议用血清培养。原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。需要的添加剂为 B27和谷氨酰胺。培养出的细胞状态均一，胶质细胞几乎不分裂。其中，neurobasal是胎鼠培养基，而-A为新生鼠培养基。不过根据笔者实验，没什么太大区别，都能很轻松培养成功，但是，切忌中途换培养基，要从一而终。很多实验室是不加抗生素的，也有的实验室加。由于很多初学者操作不熟练，不注意，很多人会污染，所以我还是建议加双抗。注意！由于无血清培养基添加剂不是血清，而是人工合成的B27（也有用N2的，但是推荐B27，只差10美金），血清有复杂的解毒作用而B27没有，双抗对细胞的干扰，无血清培养基要大的多。所以，如果你在neurobasal里添加抗生素，记得用量只要标准量的一半。另一个添加成分谷氨酰胺溶液不稳定，所以每次用时候要现配现加。大概是0.5-2mmol/l大部分人用0.5mmol/l.虽然笔者试过，没加这个也正常生长，但是几乎所有文献都添加，we just simply follow.3.解剖过程一定要全程在冰上预冷。这就意味着，从你处死母鼠后，胎鼠的大脑的温度要最快的降低到0度。另外，在解剖过程中，胎鼠直到皮层或海马被剪碎的过程，有时候可能需要2小时，如果样品多。一定要注意多准备冰袋子。确保你的任何过程都在冰浴的培养液中进行（消化步骤除外）。这样可以大大提高存活率。在解剖大脑时候，有人用hanks，在其中解剖。根据我的经验，即使是0度，神经元还是在进行着很大程度代谢。所以，hanks的无糖环境很不利。我个人建议，用DMEM-高糖或DMEM-F12+马血清来浸泡解剖过程中的大脑，来供给大脑的代谢，血清可以抑制神经凋亡。这其中还有一个问题，就是DMEM培养液会在空气中变碱性。国外有的实验室用L-15培养液来浸泡解剖过程中的脑，因为L-15不会再空气中变碱性。没有L-15的(国内几乎没有），可以全程用DMEM-HG或者DMEM-F12+血清浸泡解剖过程中的脑。注意注意：一切操作都在冰浴的液体中，所以要多准备冰袋。（中途冰袋没了的是猪头）4.关于培养皿的问题。一般来说，6孔板是最佳选择。神经元让人苦恼的问题是，神经元发育的情况和密度相关。大于6孔板（比如6CM DISH）会使得中间很难和周围的细胞密度一样，造成板中间和边缘成熟度不一样，而这会给实验带来很大干扰。而太小的话（96孔或128孔）细胞会倾向于向中间集中也会照成发育不均匀。所以笔者经验是6孔板是最佳选择。神经原代培养一定是要包被，用POLY-LYS或者胶原。关于POLY-LYS包被，我们是包被30分钟，吸干晾过夜，然后洗两次，或者只洗一次但是要30分钟接着晾干。由于neurobasal培养法相当成熟，所以没必要用难固