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17 联科生物技术有限公司 全国免费电话：800 8571 184 第三章 中和试验(Neutralization)及中和抗体 简介： 中和试验(Neutralization)是决定中和抗体对相应蛋白(或细胞因子) 的生物活性的干涉能力。本 文以中和抗体--兔抗大鼠 TNF-α为例，讲述如何用中和试验来确定此中和抗体对重组 TNF-α蛋 白的生物活性的中和/干涉能力。 原理： 用 TNF-α敏感小鼠 L929 细胞(成纤维肉瘤细胞) 的微量细胞毒试验来检测兔抗大鼠 TNF-α( 中 和抗体)对重组 TNF-α蛋白的中和能力。因为在无中和抗体存在的情况下，TNF-α对 L929 细胞 有细胞毒杀伤作用，而加入中和抗体后，TNF-α 的细胞毒作用会减弱或完全被抑制，即可得知 不同浓度的中和抗体的中和能力的高低。 实验仪器和材料： 小鼠 L929 细胞 RPMI-1640 培养液 细胞因子--重组大鼠 TNF-α，产品标号：400-14，规格：20ug，生产商：Peprotech 中和抗体--兔抗大鼠 TNF-α，产品标号：500-P72，规格：50ug，生产商：Peprotech 培养板 离心机 培养箱 实验方法： [试剂配制] 细胞因子： 8. 快速离心细胞因子(重组 TNF-α) 的冻干粉管，使管盖和管壁上的粉末收集至管 底； 9. 加入无菌的双蒸水 100ul，将细胞因子重悬配制成浓度为 0.2mg/ml 的贮存液， o o 4 C可保存 1 周，如长期保存，则需分装冻存于 -20 C ； 10. 取一定量的贮存液(0.2mg/ml)，用RPMI-1640 培养液进行 1:100,000 稀释，即 获得浓度为 2.0 ng/ml 的重组TNF-α 工作液。 中和抗体： 1. 快速离心中和抗体(兔抗大鼠 TNF-α) 的冻干粉管，使管盖和管壁上的粉末收集至管底； 2. 加入无菌的双蒸水 200ul ，将中和抗体重悬配制成浓度为 0.25mg/ml的贮存液，4 oC可 保存 6 个月，如长期保存，则需分装冻存于 -20oC ； 3. 根据细胞因子(重组TNF-α)的ED50(半数有效浓度)来确定中和抗体工作液的浓度 此细胞因子(重组TNF-α，产品标号：500-P72，生产商：Peprotech) 的ED50 为 0.05ng/ml， 配制的中和抗体工作液的浓度是此ED50 的 10000X，5000X，2000X ，1000X，500X， 200X ，即 500ng/ml，250ng/ml ，100ng/ml，50ng/ml和 25ng/ml和 10ng/ml。因此需将 0.25mg/ml 的中和抗体贮存液用RPMI-1640 工作液分别作 1:500，1:1000，1:2500， 1:5000，1:10000 和 1:25000 稀释。 全国免费电话：800 8571 184 联科杭州：0571-8822 6558 联科上海：021-6451 1079 联科北京：010-5180 5911 联科苏州：0512-6866 6623 联科厦门：0592-5322 2277 联科广州：020-8350 6317 联科武汉：139 9551 1341 联科南京： 025 联科生物技术有限公司 全国免费电话：800 8571 184 [检测步骤] 第 1 天： 1. 收集对数生长期的 L929 细胞，用培养液调细胞至适当浓度，加入培养板的小孔中，3 x 104 个细胞/孔； 2. 置 37℃，5 ％CO2 的培养箱中培养 16～24h ； 第 2 天：