WB试验常见题解答.doc

[1] 各位朋友：请教关于SDS的问题。我的配胶体系如下：15%分离胶 4%浓缩胶水 2.3ml 2.7ml30%丙烯酰胺 5.0ml 0.67mlTris-HCL PH8.8 2.5ml PH6.8 0.5ml10%SDS 0.1ml 0.04ml10%APS 0.1ml 0.04ml TEMED 0.004ml 0.004ml 我的蛋白分子量是11kd，浓缩胶60V,40min，分离胶90V，70min。跑胶时总是跑不直，呈抛物线型，请问是什么原因？我的试剂都是新配置的。谢谢！！！ 答：【1】胶的配制方法；配制不同体积15%胶 SDS分离胶所需各成分的体积(毫升) 15%胶 (毫升) ： 5 －－ 10 －－15－－ 20－－ 30－－ 50 蒸馏水 ： 0.5 －－ 1.0－－ 1.5 －－ 2.0 －－ 3.0 －－5.0 30%Acr-Bis(29:1)： 2.5 －－ 5.0 －－ 7.5 －－ 10.0 －－ 15.0－－ 25.0 1M Tris, pH8.8： 1.9－－ 3.8 －－ 5.7－－ 7.6－－ 11.4 －－ 19.0 10%SDS ：0.05－－ 0.1－－ 0.15 －－ 0.2－－ 0.3－－ 0.5 10%过硫酸铵： 0.05 －－ 0.1 －－0.15－－ 0.2 －－ 0.3 －－ 0.5 TEMED： 0.002－－ 0.004 －－ 0.006 －－ 0.008 －－ 0.012 －－ 0.02 配制不同体积4%胶 SDS浓缩胶所需各成分的体积(毫升) 4％浓缩胶（两块胶，5ml）超纯水 ： 3.16ml40％Acr/Bic（37.5：1） ： 0.5ml0.5 mol/L Tris?HCl（pH6.8） ： 1.26ml10％SDS ： 50 微升?微升?10%AP（过硫酸胺） ： 25 TEMED ： 5 微升?加TEMED后，立即混匀即可灌胶。【2】注意玻璃板一定要洗干净，这一点比较重要。如果玻璃板洗不干净，很容易造成楼主所说的现象。【3】注意电泳液不要出问题（是否过期了，是否把转移液当成电泳液了？），电泳液如果出问题，也会造成楼主所说的现象。 [2] pvdf膜到底能不能用丽春红染色来查看蛋白是否转上去 ？我转过很多次了，都没有看到过丽春红显色。但是有看到有人说能染上，是在是不知道，请教给位大大了 答：【1】PVDF膜肯定可以用丽春红染色的。我们这里的很多人基本上用 的都是PVDF膜，染膜用的都是丽春红。大多数时候都能染出条带的。【2】下面是丽春红的配方：10X丽春红染液丽春红S 2g三氯乙酸 30g磺基水杨酸 30g蒸馏水至 100ml使用时将其稀释10倍。当然现在有很多公司直接卖配好的丽春红，因为其可以回收重复利用，所以可以买配好的丽春红。下面是一份丽春红的说明书：1.将PVDF膜、硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜浸没在丽春红染色液中，摇动3-5分钟或更长时间，直至出现清晰条带。对结果作适当 记录。 2.用蒸馏水，PBS或其它适当溶液漂洗2-3次，每次3-5分钟，去除丽春红，进行后续的Western检测。 从使用说明中，我们可以看出，PVDF膜是可以用丽春红染色的。【3】我的染色方法是：转膜完成后，取出膜在甲醇里泡1分钟，然后在双蒸水中过一下，放入丽春红里染色，室温，摇床上，时间是5－30分钟。然后把染好的膜放到双蒸水中洗一下，不要洗的太久，把表面的丽春红洗掉就可以了。这时就可以看到红色的蛋白条带了。然后把膜放在TBST中，室温，摇床上洗3次，每次10分钟。然后就可以往下做了。【4】丽春红的染色敏感性和ECL敏感性差的很远呢。也就是说，及时丽春红染色染不出来，ECL 也有可能曝光曝出来的。【5】感觉丽春红染色效果不是很好的，有时候清楚，有时候也不是很清楚。而且染色后再往下做后面的结果会收到一定的影响。所以，如果熟练了，后面就可以不染色了。也可以上样的时候都上两个孔的样，转膜后把这两个孔对应的膜剪下来染色，如果染上了，说明其他的也会染上的。 [3] 我做WB，曾跑出过条带，就是有非特异性条带，准备摸一抗和二抗浓度，但后来就什么条带都显不出来了，就算换成有条带时的浓度，条件也没变，就是做不出来，转膜后膜上能清晰看见预染的彩虹marker，但用丽春红染膜，却没明显的蛋白条带，就能看见泳道，请教实验室其它人，就说是我转膜弥散，求助个位大侠，我该怎么做？说说我的wb条件：蛋白大小：50kd5％积层胶，10％分离胶电泳先100v，后180v转膜条件：冰水中恒压100v 1h 湿转（在转时电流在200—400ma变，先小，后大，还有就是转移缓冲液在转时会冒好多泡泡），我用的是NC膜