双向电泳原理与流程课件.pptVIP

Title or job number Proteomics Proteomics 一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组(proteome) 仅仅从基因组学水平上无法彻底的了解各种生命现象, 因为蛋白质才是生命活动的真正执行者 从基因组学上我们无法检测到转录后修饰、翻译调节、选择性剪切、以及蛋白复合物形成、蛋白质相互作用等生命现象; 此外并不是细胞内的所有的DNA都翻译转录成蛋白质 Proteome Analysis and Proteomics The analysis of the entire PROTEin complement expressed by a genOME, or by a cell or tissue type. Wasinger VC et al, Electrophoresis 16 (1995) “Proteomics is the study of quantitative changes of expression levels and their application to drug discovery, diagnostics and therapy.” Two basic technologies: 2-D electrophoresis of complex protein mixtures Identification and structure analysis of proteins with mass spectrometry methods Why 2DE? Only “Proteomics” is the large-scale screening of the proteins of a cell, organism or biological fluid, a process which requires stringently controlled steps of sample preparation, 2-D electrophoresis, image detection and analysis, spot identification, and database searches. The core technology of proteomics is 2-DE. At present, there is no other technique that is capable of simultaneously resolving thousands of proteins in one separation procedure. 理论 pI and Mr 图 酵母细胞表达6,216种蛋白 2D 电泳优越性 对未处理样本耐受性好 不需要预纯化 (如：色谱层析) 分辨率非常高 2D 可以有效的组分收集器 蛋白在凝胶介质中受到保护 在蛋白质组学技术中应用范围最广（front-end ） 与其他技术相比，在一次试验中可检测到的蛋白点更多 与后续分析技术兼容性好 (如. MDLC) 寻找差异蛋白质 Life Sciences 的历史 LKB ——电泳发明者 Pharmacia ——层析技术开创者 Amersham Biosciences ——提供基因组、蛋白组学研究整体解决方案 GE Healthcare Life Sciences ——实现从发现到功能研究，从体外到体内的突破 GE Healthcare milestones in 2-D electrophoresis Proteomics 2DE Workflow 小鼠肝脏蛋白提取物2D凝胶电泳 2D/MS 经典工作流程 样品制备 细胞破碎 蛋白沉淀 溶解 抑制蛋白酶活性 去除 核酸 脂类 盐，缓冲液，离子性小分子 不溶性物质 2D/MS 经典工作流程 Principle of 2-D Electrophoresis 1. First dimension:denaturing isoelectric focusingseparation according to the isoelectric point 2. Second dimension:SDS electrophoresisseparation according to the molecular weight 双向电泳：传统方法 使用载体两性电解质IEF时存在的问题 不同批次载体两性电解质的重现性 载体两性电解质梯度不稳定 蛋白载量有限 重现性差导