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医学微生物学实验 微生物学教研室 第一次 实验内容 细菌基本形态观察 （球菌、杆菌、螺形菌） 细菌特殊结构观察 （荚膜、鞭毛、芽胞） 革兰染色法 1.细菌的三种基本形态 球菌：葡萄球菌。 杆菌：大肠杆菌。 螺形菌：霍乱弧菌。 弧菌 2.细菌的特殊结构观察 芽胞示教片：破伤风杆菌。 鞭毛示教片：变形杆菌。 荚膜示教片：肺炎双球菌。 破伤风梭菌×1000 3.革兰氏染色法 【菌种】 齿垢 【试剂】 生理盐水、结晶紫、碘液、95%乙醇、复红 【材料】 酒精灯、接种环、玻片、 【结果】 细菌被染成紫色者，称为革兰氏阳性菌； 而细菌染成红色者，称为革兰氏阴性菌； 【意义】 鉴别细菌，用本法染色可将细菌分成两大类。 了解致病性 指导选择用药 【革兰氏染色法的原理 】 革兰氏染色法的原理尚未阐明，可能与以下因素有关。 1、通透性学说 2、等电点学说 3、化学学说 通透性学说 G+菌细胞壁结构致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易进入。 G-菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇易渗入。 等电点学说 G+菌等电点（pI2~3） G-菌等电点（pI4~5） 在相同pH条件下G+菌所带负电荷比G-菌多，所以与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固，不易脱色。 化学学说 G+菌菌体内含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫等染料牢固结合，使已着色的细菌不易被乙醇脱色 G-菌 菌体内含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色 注 意 事 项 涂片的厚度。 固定的程度。 染色的时间控制：一一半一。 冲洗的方法，不要对着涂片区。 95% 乙醇脱色时间。 第二次 实验内容 一、细菌基础培养基的制备（示教） 二、细菌分离接种技术（操作） 平板划线接种法；斜面培养基接种法 液体培养基接种法；半固体穿刺接种法 三、细菌在培养基上生长现象（观察） 一、细菌基础培养基制作 液体培养基制作 普通肉汤培养基成分： 新鲜牛肉浸液100ml，蛋白胨1g，NaCl 0.5g 称量，包装，灭菌后使用。 固体培养基制作 称取营养琼脂4.5g，加入100ml蒸馏水中溶解。 包装后灭菌使用。 斜面培养基制作 平板分离划线接种法 ①连续划线法 ②分段划线法 斜面培养基接种法（操作） 用途：常用于扩大纯种细菌及实验室保存菌种。 第三次 实验内容 一、细菌分布实验 空气中细菌的检查 皮肤、日常物品细菌的检查 二、药敏实验 一、细菌的分布实验 （1）空气细菌检查 材料：培养基，普通琼脂平皿 （2）皮肤（其他物品）消毒前后的细菌检查 材料：培养基，无菌生理盐水，75%酒精棉球， 2.5%碘酒棉球，无菌棉棒 （3）自来水中的细菌检查 材料：培养基，无菌棉棒，酒精灯 自来水中的细菌检查 在1个平皿底部做好标记。 用酒精灯对水管口灭菌，拧开水管开关放水15S。 取一支无菌棉签蘸取自来水，将该棉签涂布于标有消毒前的无菌琼脂平皿表面，作来回划线，注意勿划破琼脂表面。 将平皿于37℃、24h培养后取出观察平皿表面有无细菌生长，描述菌落特征。 药敏实验（纸片扩散法） 步骤（无菌操作） 1、在培养基平皿上做标记。 2、接种；用棉签分别沾取菌液（G+，G-）均匀分别涂布于2个平皿上。 3、贴药片；镊子灭菌取药片放置于平皿上的标记 位置，再灭菌后可取另一药片放置。 4、37℃，过夜培养，观察结果。 药敏实验结果 第四次 实验内容 病原性球菌标本片观察 链球菌、 脑膜炎双球菌 血浆凝固酶试验 抗“O”试验 目的要求 掌握病原性球菌的基本形态。 掌握药敏实验操作技术与判断。 链球菌 抗“O”试验（ASO test） 步骤： 第五次 实验内容 操作：肥达试验 肉毒梭菌、产气荚膜菌标本 肥达实验结果判断 血清的凝集效价（滴度）：是指能与一定量的抗原发生肉眼可见的明显凝集（即“++”凝集）的血清最高稀释倍数。血清效价代表血清中抗体的含量，血清效价越高，所含抗体的量愈多。 结果判断 1、正常凝集效价 伤寒沙门菌“O”抗体凝集效价在1：80以下，伤寒沙门菌“H”抗体在1：160以下， 甲、乙型副伤寒沙门菌“H”抗体凝集效价在1：80以下。 2、病程中动态观察 二份血清，第二次效价增长四倍以上有意义 3、O与H抗体在诊断上的意义 肉毒梭菌 第六次 实验内容 一、细菌染色标本检查法