实验一动物细胞工程综合实验20101209.doc

《动物细胞工程》综合设计实验 一、 实验目的 1 了解动物细胞培养基本设备、器材、实验室设计及实验规则。 2 掌握动物细胞培养常用液体配制方法。 3 掌握细胞传代技术。 4 学习动物细胞形态观察及活性测得方法。 二、 实验内容 （见下具体实验） 三 实验报告： 1完成细胞培养常用培养液配制 2 完成细胞传代操作，并写出细胞传代步骤和注意事项。 3用柱状图表示MTT法测定黄花蒿植物浸出液对细胞的IC50 。 4 计数活细胞百分率。 实验1 动物细胞培养液的配制 （参考细胞工程试验教程P 100） 需要配制的动物细胞培养液包括： 一、无血清培养基的配制 二、D-hanks细胞平衡液的配制 三、细胞消化液的配制 四、双抗溶液的配制 无血清培养基的配制 （各组配制100ml） 无血清培养基(): 是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。 大量组分：按照以上配方，称取所需量加入1000ml去离子水即可。 20种氨基酸混合溶液：已配备用，取量为1ml加入1000培养液即可。 维生素溶液：已配制成母液，各种微生物母液取量1ml加入1000培养液即可。 D-Hanks 细胞平衡液的配制 Hanks 溶液是生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液主要用于配制配制培养液，稀释剂和细胞清洗液，而不能单独作为细胞，组织培养液。 ? NaCl 160g ? MgSO4·7H2O 2g ? KCl 8g ? Mg Cl2·6H2O 2g ? CaCl2 2.8g ? 溶于1000ml双蒸水 ? Hanks溶液，磁力搅拌溶解后，0.22um细菌过滤器过滤除菌。-20℃保存备用。 双抗溶液配制 （已配，备用） （1）氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml）溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 链霉素（streptomycin）（50mg/ml）溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。Hanks 溶液Hanks 溶液MTT法 ???又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide， 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 MTT法缺点：???? 由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。 MTT 溶液的配制方法???? 通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。 MTT法注意事项???? MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。 MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。 MTT有致癌性，用的时候小心最好带透明的簿膜手套配成的MTT需要无菌MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉 5、MTT法实验步骤??贴壁细胞?? 1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul待测细胞调密度1000-10000孔 2.、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺孔底加入浓度梯度的药物原则上，细胞贴壁后即可加药或两小时，或半天时间，一般5-7个梯度每孔100ul设3-5个复孔 3.、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 4、每孔加入2