实验八血清蛋白的醋酸纤维膜电泳.doc

实验八 血清蛋白的醋酸纤维膜电泳 （一）目的要求 1．学习电泳的原理。 2．掌握醋酸纤维膜电泳法分离血清蛋白的基本操作方法。 （二）原理 带电粒子在电场中发生定向移动的现象称电泳。电泳方法的基本原理是利用不同带电物质在电场中移动速度不同而达到分离的目的。醋酸膜是由二乙酸纤维制成的具有均一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动的阻力小，较适宜用作区带电泳法分离物质的支持物。 血清中含有清蛋白，α1、α2、β、γ球蛋白等，其等电点各不相同，都在7以下。若将血清置于pH8.6的缓冲溶液中电泳，由于它们均表现为带负电荷，所以在电场中会向极移动。故在电场内的移动速度不同，通过电泳法可将之分离。 1．器材 （1）醋酸纤维膜（2×8cm） （2）电泳仪（带电泳槽） （3）平板玻璃 （4）点样器（用塑料垫板自制） （5）培养皿，粗滤纸，镊子等。 2．试剂 （1）新鲜动物血清（无溶血现象） （2）巴比妥缓冲液（pH8.6）：巴比妥钠12.76g、巴比妥1.66g溶于1000mL蒸馏水中。 （3）染色液：氨基黑10B0.5g，甲醇50mL，冰醋酸10 mL，水40 mL，混匀。 （4）漂洗液：95%乙醇45mL，冰醋酸5 mL，水50 mL，混匀。 （5）透明液：无水乙醇70 mL，冰醋酸30 mL，混匀。 （四）操作步骤 1．浸泡醋酸纤维膜：将醋酸纤维膜用镊子取出一张，并识别光泽面与无光泽面，用笔在膜角标上记号，然后放入缓冲液中浸泡约20分钟。待膜浸透后（有白斑的弃去），取出，用滤纸吸干多余缓冲液。 2．点样：将醋酸纤维膜平放于玻璃板上，无光泽面朝上，将点样器沾上血清在离膜条的一端约2cm处轻轻地水平落下并随即提起，于是膜条上就有了血清样品。（点样好坏是电泳图谱是否清晰的关键）。 3．电泳：在两个电泳槽内加入高等的缓冲液，并放置好浸入缓冲液的双层滤纸条作的滤纸桥。将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸架上，为防止蒸发，将点样的无光泽面朝下，点样的一端靠电源的负极。待平衡后通电。调节电压至160V，电流强度在0.4~0.7A，电泳时间约50分钟。 4．染色：电泳结束，关闭电源，将膜条取出浸于染色液染色5~10分钟。 5．漂洗：将染好色的膜条放入漂洗液中漂洗4~5次，每次浸漂3分钟左右，使背景颜色脱净为止。 6．透明：为了长期保存将漂洗后的膜条夹在干净的滤纸中吸去多余的溶液，吹干，浸入透明液中浸泡3~5分钟，然后取出平贴于玻璃板上，（不要留有气泡），用电吹风使之完全干燥后用单面刀片，刀口紧贴玻璃板进刀把整块膜取下，即成为了可长期保存不退色的血清蛋白区带透明膜。 注意事项：染色液、漂洗液、透明液应存放于密闭瓶子中，否则，易挥发成分挥发，使溶液组分比发生变化，影响实验结果。 膜条 点样线 2cm （五）思考题 在一含有多种偏酸性和偏碱性蛋白质的混合液中，用pH7的缓冲液进行电泳，是否均可得到分离，为什么？你有什么办法使之完全分离？