原生质体无菌离培养与融合.ppt

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2017-06-12 发布于河南
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原生质体无菌离培养与融合

植物原生质体的分离，培养与融合;许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高pH法和电融合法。 PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。;实验器具;实验试剂;需要灭菌的东西;原生质体的酶解与分离（无菌条件）;用350目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液，加入3～4ml13%CPW洗液，相同条件下离心，弃上清液。加1ml13%CPW洗液悬浮。 ** 蔗糖漂浮方法：（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液4ml加入另外一支离心管底部，然后将原生质体的悬液小心加在蔗糖界面上。由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面(注意要有明显界??). (2) 1000转/分离心5分钟，此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处， (3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心收集沉淀，用13%CPW的CPW重新悬浮。 ;原生质体培养;细胞融合（有菌条件）