端粒酶活性检方法的研究进展2008.doc

端粒酶活性检测方法的研究进展2008-10-07 22:00　　 摘要: 近几年研究表明端粒酶与肿瘤的发生发展密切相关，推测可能是一个广泛的肿瘤标志物。本文就端粒酶活性检测的原理，端粒酶的提取方法，TRAP扩增技术，四种结果分析方法（同位素法、染色法、荧光法和ELISA法）以及如何进行质量控制与半定量测定进行综述。 　　端粒酶（Telomerase）是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶。人端粒酶RNA组分（hTR）于1995年被克隆，其中含有端粒重复序列的模板（5′-CUAACCCUAAC-3′）；蛋白质组分具有RNA依赖的DNA多聚酶活性，结构尚不清楚。端粒酶能以自身RNA的模板区为模板复制合成端粒序列。在胚性细胞等增殖活跃的细胞中具有端粒酶活性，而在正常成熟体细胞中端粒酶失活，同时还发现绝大多数肿瘤细胞都呈端粒酶阳性，而在癌旁组织和正常组织阳性率很低，推测端粒酶可能是一个广泛的肿瘤标志物[1]。因此近几年端粒酶在各种肿瘤中的研究日益深入，同时促进了检测方法的改进与完善。本文对其检测方法综述如下。 　　1 基本原理 　　端粒酶在体外可以以其自身RNA的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6个碱基的重复序列，用聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳可显示6个碱基差异的梯带。1994年Kim建立了基于PCR基础上的端粒重复序列扩增法（telomeric repeat amplification protocol, TRAP）。TRAP反应原理见下图。 　　首先合成一个18nt的TS做上游引物，端粒酶结合TS末端的GTT并合成agggttag，然后每经过一次转位合成一个ggttag的6碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入一个24nt的CX做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。 　　2 基本技术方法 　　2.1 标本来源 手术摘除组织，针吸活检组织，胸水，腹水，膀胱或胰管冲洗液，棉拭子所取分泌物和尿液（尚有争议）等。 　　2.2 端粒酶的提取方法 早期采用超声等物理破碎的方法在不同细胞中的提取效率差异较大，此后采用去污剂（如CHAPS）裂解的方法在少量细胞获取了较稳定的端粒酶提取液。现详述如下：40～100mg冷冻（-70％℃）组织或104～106沉淀细胞用冰预冷的洗液[10mM hepes-KOH(pH7.5), 1.5mM MgCl2, 10mM KCI, 1Mm DTT]洗1次，10000g4℃离心1min，沉淀加200μl冷裂解液[10mM tris-HCI(Ph7.5), 1mM MgC12,1mM EGTA, 0.1mM PMSF, 5mM β-巯基乙醇，0.5％CHAPS，10％甘油]，自动匀浆器冰浴中匀浆，450rpm,25min, 16000g4℃离心20min，移取上清160μl，部分样品用于蛋白定量，其余迅速冷冻，-70℃保存。端粒酶经小于10次冻融可保持活性稳定。部分学者对某些标本用0.5％Tween-20代替0.5％CHAPS获得更好的效果[2]。 　　2.3 TRAP扩增 50μlTRAP体系包含20mM tris-HCI(pH8.3)，1.5mM MgCI，63mM, KCI, 0.005％Tween-20，1mM EGTA, 50μMdNTP，0.1μg tS，1μg T4基因32蛋白，0.1mg/ml牛血清白蛋白，1～2μlCHAPS细胞提取液（含6μg）蛋白，0.2～0.4μl[α-32P]dGIP或[α-32P]dGIP(10μCi/μl, 3000Ci/mmol)，这一反应体系可同时满足端粒酶Tap聚合酶的活性需要，23℃10min合成端粒酶延伸产物后，94℃3s灭活端粒酶，加入0.1μg cX和2U Taq酶，94℃30s，50℃30s，72℃1.5min扩增27个循环，25μl产物进行15％PAGE 凝胶电泳。 　　2.4 引物设计 为了防止上、下游引物之间的结合，在CX引物上设计了3个不匹配碱基（见图1*处），单链结合蛋白T4基因32蛋白可进一步避免引物之间的结合，TS和CX引物被广为采用，在上述条件下，只有延伸了三至更多的GGTTAG片断才有特异扩增，即得到从40bp开始的6bp差异的梯带。Broccoli等以5′-GGCGCG(ACCCTA)3-3′代替CX引物，由于增加了G-C含量，可提高退火温度，进一步避免引物间的结合，增加特异性[3]。Oncor公司设计RP引物代替CX引物，得到从50bp开始的6bp差异的梯带[4]。 　　3 扩增片断的检测 　　3.1 同位素法 Kim建立的方法即为同位素法，其应用最多。采用[α-32P]dGTP或dCTP掺入的报道很多，但部分学者用[γ-32P]dATP和T4激酶标记TS引物的5′端，发现更易于检出