乙型脑炎减毒疫苗细菌内毒素检查凝胶法研究.doc

乙型脑炎减毒活疫苗细菌内毒素检查凝胶法研究 建立乙型脑炎减毒活疫苗细菌内毒素检查方法和质量标准，检测样品中的内毒素含量。方法 中国药典2010年版三部细菌内毒素检查法(凝胶限度试验、凝胶半定量试验)。结果 选用λ为0.5 EU/ml的鲎试剂，采用凝胶限度法对乙型脑炎减毒活疫苗进行细菌内毒素检查，样品经稀释至80倍或以上稀释度后对内毒素检查均无干扰，确定该疫苗的内毒素限度值为40 EU/ml[即20 EU/剂(0.5 ml)]。凝胶限度试验结果显示，疫苗每1 ml中含内毒素的量均小于40 EU，即每1次人用剂量(0.5 ml)中含内毒素的量均小于20 EU。凝胶半定量测定结果显示，1人份规格疫苗中含内毒素的量为2.50~10.00 EU/ml(平均5.36 EU/ml）；5人份规格疫苗中含内毒素的量为1.50~6.00 EU/ml(平均3.02 EU/ml）。结论 凝胶法两种试验均可用于乙型脑炎减毒活疫苗细菌内毒素检查，与凝胶半定量试验相比，凝胶限度试验更为简便、且易于操作；采用凝胶限度法本研究建立了乙型脑炎减毒活疫苗细菌内毒素检查方法和质量标准；凝胶半定量法测定结果用准确数据显示该疫苗的内毒素含量均在人体安全限度以内。 流行性乙型脑炎(筒称乙脑)是危害儿童身体健康较严重的一种传染病，目前疫苗接种是预防乙脑的有效措施。SA14-14-2株乙型脑炎减毒活疫苗(简称乙脑活疫苗)是我国独创的一种安全、有效的预防性生物制品，自1988年被批准在卫生部成都生物制品研究所首家生产以来，已累计在国内外上市十余亿人份。该产品已先后被《中国生物制品规程》[1～3]、《中国药典》[4～5]和世界卫生组织(WHO)规程[6]收载，但目前尚未被现行版美国药典 [7]、欧洲药典[8]和英国药典[9]收载。《中国药典》2010年版三部收载的乙型脑炎减毒活疫苗未规定对制品进行细菌内毒素检查，WHO规程对此项也未作规定。为建立乙脑活疫苗细菌内毒素检查方法和质量标准，控制生产过程中可能源自细菌内毒素的污染，进一步提高产品的安全性，根据国家药典委员会病毒专业委员会的专家建议，现采用《中国药典》细菌内毒素检查法[5]中凝胶限度试验和凝胶半定量试验方法，对成都生物制品研究所(简称成都生研所)生产的乙脑活疫苗(规格:1人份/瓶、5人份/瓶)进行细菌内毒素检查研究。 1 材料与方法 1.1 材料、仪器 1.1.1 试验样品 为冻干注射剂，由成都生物制品研究所提供。乙脑活疫苗（1人份/瓶）11批，批号：201007A091-3、201008A096-3、201010A099-2、201010A112-2、201011A114-4、201102A050-2、201103A082-4、201103A085-2、201104A090-2、201104A091-3、201106A132-3。乙脑活疫苗（5人份/瓶）11批，批号： 200901C004-3、200901C009-3、200901C012-2、200906C014-3、200911C016-1、201002C001-3、201003C017-1、201004C028-2、201004C033-1、201004C045-3、201005C064-3。 1.1.2 细菌内毒素工作标准品：规格：120EU/支，批号:150601-200963，购自中国药品生物制品检定所。 1.1.3 鲎试剂 灵敏度：0.5EU/ml，批号：1006101，由湛江安度斯生物有限公司生产。灵敏度：0.5EU/ml，批号由福州新北生化工业有限公司生产。 1.1.4 细菌内毒素检查用水 规格：50ml/瓶，批号：1103100，由湛江安度斯生物有限公司生产。 1.1.5 主要仪器 试管恒温仪（型号：TAL-40D）, 由湛江安度斯生物有限公司生产。 1.2 方法 1.2.1 供试品制备 取本品(两种规格)，每瓶按标示量用疫苗稀释剂复溶(每人份0.5ml)，再用BET用水稀释，备用。 1.2.2 供试品细菌内毒素限值（L）及最大有效稀释倍数（MVD）确定 疫苗使用说明书显示，乙脑活疫苗为冻干注射剂，主要免疫对象为8月龄以上健康儿童，皮下注射，0.5ml/剂量。根据文献[10], L(EU/ml)=K/M，式中：K为按规定的给药途径，人体每千克体重每小时(h)最大可接受的不产生任何不良反应的细菌内毒素剂量(亦称致热阈)，计算单位EU/(kg.h)；M为按规定的给药途径，人体每千克体重每小时给药的最大剂量，计算单位ml/(kg.h)。根据注射剂K=5EU/(kg.h)，儿童体重(以10kg计), 注射时间(不足1h计为1h)，注射剂量(0.5ml/h)，计算得出L=100EU/ml，即为该疫苗供试品的内