SPA的表达、制备及鉴定.doc

目录 【摘要】 2 【关键字】 2 1．前言： 2 1．1 背景 2 1．1．1 金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A，SPA) 2 1．1．2 大肠杆菌 4 1．1．3 SDS（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳） 4 1．1．4 western blotting（Western免疫印迹） 4 1．2 目的 5 1．3 原理 5 1．3．1 SPA的原核表达 5 1．3．2 蛋白的提取 6 1．3．3 SDS 7 1．3．4 western blotting（Western免疫印迹） 8 2．材料与方法： 9 2．1 材料： 9 2．2 方法： 9 2．2．1 SPA的原核表达 9 2．2．2 蛋白质的提取 11 2．2．3 SDS 11 2．2．4 western blotting 14 小结与心得体会 16 参考文献 16 【摘要】构建携带Staphylococcal protein A(SPA) 基因的原核表达载体，诱导表达具有活性的SPA。然后再通过western blotting，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。SDS，western blotting 1．前言： 1．1 背景 1．1．1 金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A，SPA) 金黄色葡萄球菌细胞壁的成分占整个细胞壁蛋白的6.7％，通过胞壁肽聚糖以共价键与之结合。SPA 能与人及多种哺乳动物血清 IgG 中的 Fc 片段结合，但亲和性各不相同。此外，其还能与血清中少量的IgM 和IgA 结合[1]。因此已广泛的应用于IG 亚类的检测和分离纯化，酶的固定化及各类生物分子的检测等。SPA 还能部分去除肿瘤患者和带瘤动物血清中的封闭抗体，从而降低血清对淋巴细胞介导的细胞毒的封闭作用。由于SPA 的一些特殊的免疫学特性，引起广大免疫学者的关注，并逐渐发展成为免疫学上一种极为有用的工具。近年来，有关SPA 分泌型融合体系的构建已日趋完善，并已广泛用来在细胞中表达、纯化异源基因的产物[2][3][3]。 SPA的生物学特性[4]1．免疫原性与过敏原性 SPA做为免疫原能刺激免疫活性细胞合成Ig，又能与其相应抗体的Fab段结合呈现抗原抗体的特异性反应。SPA－IgG注射家兔皮下可引起Arthus样反应，还可引起豚鼠的迟发性超敏反应。SPA体外试验，能刺激豚鼠离体回肠收缩。2．抗吞噬作用 由于IgG的Fc段结合点既是lgG调理活性结合点，又是SPA反应点。因此，SPA可与吞噬细胞竞争，结果抑制了多形核白细胞的吞噬作用，也可能是SPA阻断调理素与吞噬细胞作用的结果。3．固定补体 SPA－IgG和免疫复合物一样可以固定人和某些动物(如豚鼠、猪、狗等)血清中的补体，主要是通过补体传统激活途径。4．促有丝分裂因子 SPA是一种B细胞激活剂，固相SPA作用明显，并不需要T细胞辅助,可容性SPA作用微弱，必须有T细胞参与。5．去封闭作用 固相SPA能部分去除肿瘤病人和带瘤动物血清中的封闭活性，从而降低了血清对淋巴细胞介导的细胞毒的封闭作用。SPA的应用[5]1．SPA菌的协同凝集作用用已知的标准血清，吸附到SPA菌的表面,使之成为吸附抗体的载体,再以此去诊断相应的未知抗原而产生肉眼可见的凝集颗粒,诊断的抗原可以是颗粒性的,也可以是可溶性的。此种凝集相当于反向间接血凝,但省去间接血凝中的抗体纯化,红血球鞣化等复杂手续,而只需要 SPA菌体及粗制免疫血清即可。所以此法简单、快速,特异性敏感性均较满意。目前已用于许多细胞和病毒的检测及分型。协同凝集只适用于检测抗原，未见应用于检测抗体的报道。2．作为广谱第二抗体 用SPA代替抗体IgG的第二抗体，有如下优点：SPA制备容易，性质稳定，易纯化，对人和多种哺乳动物的IgG都能应用,不受种属限制。而第二抗体的制备比较麻烦，且需多次免疫动物，在应用上要受同种属的限制；SPA的结合力强，相当于游离抗体与抗原的结合力，对人和兔的亲和常数均为103 L/克分子，结合后对IgG的活性无影响。无论在0、37、44及56几乎均能立即结合而无需长时间的孵育，因此可以缩短试验时间，第二抗体在较长的孵育中，出现抗原分解的问题也可以得到解决；SPA容易标上125 I、荧光素、辣根过氧化物酶、铁蛋白等，因此可与多种技术相结合；在检查细胞上的病毒抗原时，第二抗体往往特异性不强，会非特异性地与细胞膜上的Fc受体结合。SPA分子高度均一，它不是免疫球蛋白，不受Fc受体影响，所以有较高的抗IgG特异性；用第二抗体做免疫沉淀试验时，必须将抗免疫球蛋白的浓度调整至等价，才能产生最佳的沉淀作用。而用SPA菌沉淀，不受此限制，能保证彻底的沉淀；SPA与lgG结合是可逆的，用4mol