流感病毒实验室检测-培训课件.ppt

* 国家流感中心定期组织对各流感监测网络成员单位进行新技术培训，重点加强未成为省级流感参比中心的省级疾病预防控制中心监测技术的培训。省级疾病预防控制中心每年组织对本省（区、市）的专业技术人员的培训，重点加强不具备病毒分离能力网络实验室的培训。 各网络实验室可选派专业技术人员至省级疾病预防控制中心或国家流感中心进修。 根据流感监测工作要求，国家流感中心和省级疾病预防控制中心可派出专家对部分网络实验室所在疾病预防控制中心技术人员进行现场示范和指导。 * 国家流感中心定期组织对各流感监测网络成员单位进行新技术培训，重点加强未成为省级流感参比中心的省级疾病预防控制中心监测技术的培训。省级疾病预防控制中心每年组织对本省（区、市）的专业技术人员的培训，重点加强不具备病毒分离能力网络实验室的培训。 各网络实验室可选派专业技术人员至省级疾病预防控制中心或国家流感中心进修。 根据流感监测工作要求，国家流感中心和省级疾病预防控制中心可派出专家对部分网络实验室所在疾病预防控制中心技术人员进行现场示范和指导。 * ■ 接种病毒方法 ◆ 单腔接种 盲种 ◆双腔接种 灯下接种 开窗接种 鸡胚分离方法 鸡胚分离流程（1） ◆将标记好的鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，通常每个样本接种3个鸡胚 ◆用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10x6mm窗口 ◆用注射器吸200μl处理过的临床标本，装上16 号针头 ◆从窗口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯下即 可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的 鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射100μl标本。将针头退出至? 寸，将另外100 μl标本 注入鸡胚尿囊腔 鸡胚分离流程（2） ◆用同一注射器和针头将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚 ◆将针头弃于合适的生物安全装置中 ◆用消毒过的医用胶布封口 ◆ 33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养2天 鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去 鸡胚分离流程（3） ■收获尿囊液和羊水 ■鸡胚在收获前应4℃过夜或至少放置4小时 ■标记15ml 无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致 ■用70%～75％酒精消毒鸡胚顶部 ■用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。用10ml 吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。用吸管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。羊水较少时也可以将3个鸡胚的羊水合并 鸡胚病毒鉴定 经HA试验阴性者，将羊水和尿囊液混合，继续盲传1代（72小时），如仍为阴性，则鸡胚病毒分离为阴性，标本可弃去 鸡胚收获 HA试验 病毒鉴定 红细胞凝集 红细胞凝集抑制试验 病毒鉴定流程 红细胞凝集试验 4个凝集单位配制“回滴” 红细胞凝集抑制试验 判定流感病毒型别 红细胞凝集试验（HA） MDCK细胞或鸡胚收获的标本分离物首先用鸡、豚鼠或人红细胞进行红细胞凝集试验（HA），确定病毒滴度 原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能结合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有这两种成分。因此流感病毒能与其结合并识别，产生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血凝素结合后，可以抑制凝集现象出现 A H B C D E F G 100ul病毒液 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 稀释完病毒液后加入50ul红细胞悬液 50ulPBS 稀释病毒 加入配制好的红细胞悬液 充分混匀，置室温孵育30-60分钟 观察记录结果 病毒 原液 1：2 1：128 HA： 32 HA＞128 HA： 4 红细胞凝集试验（HA） HA滴度≥8，进行红细胞凝集抑制（HI）试验；HA滴度8者，继续在敏感的MDCK细胞系或鸡胚上进行传代培养，使其HA滴度≥8后，再进行HI测定 若传1～2代后，HA滴度仍8者，可应用核酸检测方法进行鉴定 红细胞凝集抑制（HI）试验 HA试验完成后，用国家流感中心每年提供的抗A（H1N1）、抗A（H3N2）、抗B（Victoria系）和抗B（Yamagata系）4种标准参照血清，进行红细胞凝集抑制（HI）试验，确定病毒的型别和亚型，进行HI试验时，需同时进行4种标准抗原对照。 红细胞凝集抑制试验步骤 4个凝