蜕皮甾酮在Caco2细胞模型中的摄取、跨膜转运及外排研究.doc

蜕皮甾酮在Caco-2细胞模型中的摄取、跨膜转运 及外排研究 邱峰1，，2，邱宗荫2* (1.重庆医科大学附属第一医院，重庆400016；2. 重庆医科大学药学院，重庆 400016 ) 摘要 目的 以Caco-2细胞单层膜研究蜕皮甾酮（EDS）的细胞摄取、转运及外排特性。方法 采用普通Caco-2细胞模型、表达活性CYP3A4酶的Caco-2细胞模型、P-gp表达抑制的Caco-2细胞模型，分别从AP?BL和BL?AP方向研究EDS的摄取、跨膜转运及外排规律。结果 EDS在3种模型中的表观渗透系数（Papp）在0.1×10-6～1×10-6 cm/s之间，药物吸收情况为1％～10％；在4 h的实验过程中，4种浓度EDS的ER值均小于1.5；当Caco-2细胞模型的P-gp表达被抑制后，EDS的吸收有一定增加，但不超过1.7倍。结论 EDS主要以被动扩散的方式被细胞摄取和转运，其跨膜转运特性未受到CYP3A4-介导的机制的影响；EDS有可能是P-gp的底物。 关键词 蜕皮甾酮，Caco-2细胞模型，1?,25-二羟维生素D3，体外吸收，表观渗透系数 蜕皮甾酮（ecdysterone，EDS）是一种甾体类昆虫生长代谢调节激素，最早被昆虫学家研究。药理学研究证明蜕皮甾酮具有促进蛋白合成，调节糖脂代谢，调节免疫及影响中枢胆碱能神经递质代谢等多方面的药理活性。我们过去的研究工作首次报道了EDS具有改善胰岛素抵抗的作用，可能是一种新型的非噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂FDA从生物药剂学角度对Caco-2细胞用作新药筛选模型进行了评价，并批准用药物筛选DMEM培养基（高糖）（Hyclone公司）；荧光黄、盐酸普萘洛尔（PRO）、维拉帕米（VER）、Hank’s液均购自Sigma公司；1?,25-二羟维生素D3（1,25-(OH)2-D 3）（重庆药友制药有限责任公司）；EDS（96.5%）（重庆医科大学药物分析实验室）；甲醇（色谱纯）；其余试剂均为分析纯；水为超纯水。 1.2 细胞 Caco-2细胞株（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）。 1.3 仪器 LC-6AD高效液相色谱仪、SPD-10Avp紫外-可见检测器、荧光分光光度计（日本岛津公司）；CS501电热恒温水浴锅（重庆实验设备厂）；超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；倒置显微镜（重庆光学仪器厂）；CO2恒温恒湿培养箱（重庆汗瞻仪器有限公司）；数显恒温水浴箱（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；Millicell ERS电子伏欧Millicell?-PCF (0.4 ?M，30 mm)插入式细胞培养皿g EDS，溶于0.1 mL二甲亚砜，用Hank’s液定容至10ml。 含VER（50 μmol/L）EDS溶液的配制：精密称取2.4mg VER溶于100 μmol/L的EDS溶液，定容至10 mL，以100 μmol/L的蜕皮甾酮溶液稀释10倍。 1.5 Caco-2细胞体外跨膜转运模型的建立与评价 Caco-2细胞培养于10%FBS-DMEM培养基、37℃、5%CO2、湿度90%。将细胞按5.67×105 cells/mL 接种于Millicell?-PCF培养皿（0.4 mL/孔），并置于加入DMEM培养基（0.6 mL/孔）的24孔细胞培养板中。隔天换液培养。一周后，CYP3A4-Caco-2模型用含1,25-(OH)2-D 3（25 ?mol/L）的DMEM培养基每天换液培养；普通Caco-2细胞模型仍用DMEM培养基每天换液培养；P-gp(-)-Caco-2模型是在普通Caco-2细胞模型基础上，在进行跨膜转运试验时，将含50 μmol/L VER的EDS溶液用于试验。培养21～25天后，以细胞单层模型跨膜电阻（Transepithelial electrical resistance，TEER）、表观通透系数（The apparent permeability coefficients，Papp）和形态学三种指标评价Caco-2细胞单层模型的完整性[7]；同时，以PRO为对照药物进行系统适用性试验[8]。 1.6体外跨膜转运实验 将EDS溶液分别加在Caco-2细胞模型的肠腔侧（Apical side，AP）或基底侧（Basolateral side，BL），从AP?BL和BL?AP两个方向考察药物的跨膜转运情况。将EDS（50、100、200、400 μmol/L）分别作用于普通Caco-2细胞模型、CYP3A4-Caco-2细胞模型；同时，将含VER（50μmol/L）的EDS溶液（100 μmol/L）作用于普通Caco-2细胞模型，形成P-gp表达抑制的P-gp(-)-Caco-2细胞模型，并进行跨膜转运实验。 AP?BL跨膜转运：A