酶工程七酶分子定向进化3.ppt

酶工程Enzyme Engineering;第七章 酶分子定向进行;;定向进化示意图;;;酶定向进化的基本过程;;第一节 酶基因体外随机突变;一、易错PCR技术;;;易错PCR示意图;;;;二、DNA重排技术;DNA shuffling;DNA重组装原理图 (DNA shuffling);;;1、交错延伸PCR技术;;StEP过程;;2、随机引物体外重组技术;;与常规DNA 改组相比,RPR 技术有如下优点:;三、基因家族重排技术;;;单链化;第二节 酶基因突变的定向选择;一、突变基因文库的构建;（一）构建基因文库的质量要求;;;（二）构建突变基因文库的主要过程;1. 载体的选择;;;;;;;;;;;2. 基因重组;;;;;;;;同聚加尾法;衔接物(linker)连接;;DNA接头 (adapter)连接法;;;1972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。;;用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。; ; ;④缺点：;（3）DNA接头 (adapter)连接法;;;;;3. 组装突变基因文库;大肠杆菌转化（transformation);in vitro packaging of lambda phage;重组λ噬菌体转导（transduction);重组λ噬菌体转导(transduction);二、突变基因的筛选;（一）定向选择环境条件的设定;;（二）高通量筛选技术;;1、平板筛选法;（1）依据细胞生长情况筛选突变基因;（2）依据颜色变化筛选突变基因;（LacZ基因 N端序列）;;磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚； ;;（3） 根据透明圈情况筛选突变基因;豆豉纤溶酶（douchi fiberolytic enzyme，DFE）;2、荧光筛选法;;巨细胞病毒启动子 ;绿色荧光蛋白(GFP);;β-半乳糖甘酶基因（lacZ）;;珊瑚虫荧光蛋白 Anthozoan fluorescent proteins;;3、噬菌体表面展示法Phage surface display ;;;外源蛋白与噬菌体外膜结构蛋白的结合方法;;;;淘洗方法：（亲和→洗脱→扩增→亲和）循环 淘选（Panning) 非筛选（Screening) ;;Typical molecular display selection processing as demonstrated with the phage display method.;4、细胞表面展示法;（1）酵母表面展示法 Yeast Surface Display;;酵母细胞表面展示表达系统构成;;;① 目的蛋白-α凝集素表面展示系统;;② 目的蛋白-a凝集素表面展示系统;;;③ 目的蛋白-絮凝素表面展示系统;;;（2）细菌细胞表面展示法 Bacterial Cell Surface Displa;革兰氏阴性菌表面展示技术;Gram(-) cell;;periplasm;革兰氏阳性菌表面展示技术;;;5、核糖体表面展示法 Ribosome Display，RD;;第三节 酶分子定向进化的应用;某些酶定向进化结果;一、提高酶的催化活性;二、增强酶的稳定性;;三、改变酶的底物特异性;;思考题