【2017年整理】5碱性磷酸酶米氏常数的测定.ppt

实验八 碱性磷酸酶米氏常数的测定 石 巍 一、目的要求 1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定的原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。 二、原理 一、分光光度法的基本原理及方法 （一）利用吸收光谱对物质进行定性分析 1．原理 （二）利用吸收光谱对物质进行定量分析 1．原理 Beer-Lambert（比尔）定律： T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I A=KCL 其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度； K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度 2．常用方法 （1）标准曲线法 OD或Ａ 　　　　　　　　　　　　　　　　　浓度 标准曲线与样品的测定条件必须一致。 （2）标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。 （3）摩尔吸光系数法 C=A/?（?为L=1cm，C为1mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。 (二)米氏常数的测定原理 酶促反应v-[S]曲线 v [S] 推导出米氏方程为： 其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km 为米氏常数 米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。 测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即： 以1/v对1/[S]作图，可得一条直线 1/v 1/Vm -1/Km 1/[S] 本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm. 反应式：pNPP+H2O pNP+HPO42- 无色 黄色 可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。 二、分光光度计的使用 仪器操作键介绍 “方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式—— 透射比（T）、吸光度（A）、已知样品浓度值（C）、已知标准样品斜率（F） “100%”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度) “0%”键：用于自动调整零透射比 “波长设置”旋钮：用于设置分析波长 3.样品测试操作 ① 打开电源开关，使仪器预热20分钟 ② 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上 ③按“方式键”（MODE）将测试方式设置为透射比（T） ④将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中 ⑤打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿和黑体分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖 ⑥盖好样品室盖，将黑体推或拉入光路，按“0%”键调透射比零 ⑦将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%”调100.0 ⑧按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度（A） ⑨将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数 实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。 三、操作方法 （一）对硝基苯酚标准曲线的制作 取5支试管编号,0号一支,1－7号各二支,按下表操作： 管 号 0 1 2 3 4 5 6 pNP含量 (?mol) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.5?mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5