大肠杆菌基因工程-培训课件.ppt

大肠杆菌基因工程 201220131271 韩武 生物技术一班 大肠杆菌的基因工程 一 大肠杆菌表达的优缺点 二 大肠杆菌工程菌的构建策略 三 大肠杆菌工程菌构建，分析，筛选 四 大肠杆菌生产实用重组蛋白 基因工程步骤 01 02 03 06 05 04 菌种贮存与保护 目的基因的表达与筛选 受体细胞的增值 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因获取 目的基因的获取 方法 1 从基因组文库获取 2 pcr技术扩增目的基因 3 通过dna合成仪用化学方法合成 表达载体的构建 外源基因在大肠杆菌中高效表达原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数 将目的基因导入受体细胞 对于大肠杆菌微生物来讲可以用ca+2处理大肠杆菌，再将目的基因的载体转移到大肠杆菌中。 启动子最佳距离的探测 E E A E E 启动子 A 酶切开 Bal31酶解 目的基因 启动子 启动子的筛选 Apr ori galK pKO1 终止密码子 采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段克隆到启动子探针pko上。 受体细胞染色体DNA上的galE、galT 与质粒上报告基因galk的表达产物联 作用。可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质 转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株 含有外源启动子活性的重组克隆 1 启动子 启动子构建 -35区序列 -10 区序列 PlL PrecA Ptrp Plac PtraA Ptac 启动子 T T G A C A G A T A C T T T G A T A T A T A A T T T G A C A T T A A C T T A G A C A T A A T G T T T T A C A T A T A A T T T G A C A T A T A A T Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac 启动子构建 终止子 终止子选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选 核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS） 核糖体结合位点 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列 密码子 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率 并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是 生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体fX174）基因组中， 密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC丰富的生如链霉菌）基因组中， 第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势 密码子与反密码子相互作用的自由能 细胞内tRNA的含量 按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法 质粒拷贝数 将质粒导入大肠杆菌中，在大肠杆菌生长达到对数期时，质粒会大量拷贝增殖，进而对大肠杆菌生长以及目的基因表达产生阻碍。故应将重组质粒控制在可控范围内。 大肠杆菌基因工程菌构建 包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 大肠杆菌工程菌构建 这些构建大肠杆菌工程菌的方法，都是利用大肠杆菌本身特性，来达到目的基因高效、稳定、快速表达。 目的基因导入受体细胞