副猪嗜血杆菌的病原学检测-培训课件.ppt

Hps标准阳性血清的制备 免疫原的制备 每种血清型标准菌株分别免疫3只家兔。 免疫程序 首次免疫用0.5毫升（含菌量为109CFU）与等量的福氏不完全佐剂充分混合，在颈背部皮下分四点注射兔子。 两个星期后,将菌液浓度增至4×109 CFU/mL，再与等量的福氏完全佐剂混合以同样的方法作第二次免疫。 两个星期后,用4×109 CFU/mL的菌液经兔耳静脉注射,每间隔2d注射一次,连续三次;最后一次注射一个星期后采血检测,琼脂扩散试验结果为阳性者,即可颈动脉放血,分离血清。 未达到要求的,则应继续加强免疫。同时采集分离未免疫家兔的血清,作为阴性对照。 副猪嗜血杆菌的病原学检测RESEARCH ON DETECTION OF HAEMOPHILUS PARASUIS 汇报内容 研究背景 研究的主要内容 结果与分析 小结 研究背景 随着我国规模化养猪业的发展，副猪嗜血杆菌感染有明显增加趋势，已成为猪场保育仔猪发病率和死亡率增加的重要原因之一，造成重大经济损失。 由于需要从病原学角度证实，而我国缺乏用于副猪嗜血杆菌检测的标准血清及诊断方法，因此我们开展相关研究。 解决方法 1 分离鉴定副猪嗜血杆菌。 进行副猪嗜血杆菌的流行病学调查，从而生产相对于主要流行优势菌株的疫苗。 建立副猪嗜血杆菌的快速诊断方法，为控制该病提供前提。 研究的主要内容 1．病原的分离鉴定。 2．标准血清、分型方法的建立和临床应用。 3．转铁结合蛋白PCR诊断方法的建立和临床应用。 第一章 副猪嗜血杆菌的分离鉴定 病料采集 　　　　剖检样品的病变表现为胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。我们采集病变的肺脏和扁桃体作为病原分离的样本。 病原菌分离方法 　　　 在无菌操作条件下从疑似病猪的肺脏和扁桃体等病料中取样, 在巧克力琼脂平板或TSA培养基上划线接种, 37 ℃培养48 h后挑取单个菌落,转接相同的培养基再进行纯培养。 涂片镜检 挑取上述纯培养菌落涂片,革兰氏染色后观察细菌形态。  分离鉴定两株副猪嗜血杆菌 分离菌株溶血性测定 16s rRNA－ PCR鉴定 两株副猪嗜血的血清型鉴定 用本实验室制备的Hps标准阳性血清对本地分离菌株进行血清型鉴定。 (1) 琼脂扩散方法：湖北分离株血清型为5型，湖南分离株则未能检测出血清型。 (2) 间接血凝抑制方法: 检测出湖北分离株的血清型为5型，湖南分离株的血清型为13型。 分析与讨论 对于Hps 分离较为困难, 需要在典型新鲜病料的采集、适宜的培养条件及分离者的判断经验上更为关注, 才能提高其临床分离率。 这两株副猪嗜血杆菌分离株对麦芽糖、葡萄糖、蜜三糖、木糖、阿拉伯糖、D-核糖、接触酶、氧化酶、甘露醇、山梨糖、乳糖、尿素酶反应表现为一致,但对蔗糖、半乳糖、果糖、和H2S、山梨醇、甘露糖的生化反应不一致。 第二章 副猪嗜血杆菌的血清学分型方 法的建立和临床应用 标准抗原制备 制备 分离株分型 标准阳性血清 家兔免疫 分型方法的建立 检测抗原的制备 盐析抗原(Salt Antigen) 含菌量为1.8×109 CFU/mL 煮沸抗原(Boiled Antigen) 含菌量为3×109 CFU/mL 热稳定抗原（Heat-stable Antigen） 含菌量为1.8×109/mL 结果分析 免疫后抗体产生的规律(Hps-5、Hps-1为例) Hps-1（玻片） Hps-1（琼扩） 抗血清效价检测 抗血清的在两种检测方法中的特异性 抗血清的保存期测定 将所保存的不同时期的Hps-5抗血清用于玻片凝集试验。 分离株的鉴定 将保存的96株副猪嗜血杆菌制作成相应的热稳定分型抗原，利用本试验制备标准阳性血清，采用琼脂扩散试验进行分型。 分析与讨论 标准副猪嗜血杆菌在家兔内产生抗体的强弱。 本研究中探索了琼脂扩散方法和玻片凝集方法在副猪嗜血杆菌血清分型中的应用。 三种分型抗原在琼脂扩散分型方法的应用。 第三章 副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白 PCR诊断方法的建立和临床应用 副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白tbpB保守序列的筛选 标准副猪嗜血杆菌（15个血清型）tbpB的检测 该方法灵敏性、特异性检测 人工感染病料和临床病料的检测 讨论分析 副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白tbpB保守序列的选用 将tpbB-PCR检测的目的片段在NCBI网站上经过BLAST比对后发现，该基因5’端225bp到514bp（288个nt）片段在大部分Hps中保守． 不同血清型副猪嗜血杆菌tbpB的检测 对15种血清型的标准Hps进行扩增，由结果