2第一章组织培养实验室及操作技术.doc

第一章 组织培养实验室及操作技术 第一节 实验室设置及基本技术 组织培养实验室必须满足三个基本的需要，即：实验准备，包括培养基配制、洗涤与灭菌等；无菌操作；控制培养。 一．实验室组成 1、准备室 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。 2、缓冲室 缓冲室的功能主要是工作人员进行服、口罩拖鞋等的更换也是其他实验室电力控制器的安装场所，需安装紫外灯进行灭菌。 3、无菌操作室 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外， 应行密闭。 4、培养室 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。主要设备应有培养架子、灯光、通风设施、边台等。另还应具有空调机、除湿机、温度湿度计、换气扇等。 5、驯化室 通常在温室的基础上营建，要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪等。 6、温室 内配置有温度控制装置、通风、光照调节装置、杀菌杀虫工具。 7、细胞学实验室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥， 使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。 8、生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。 组织培养实验室布局的总体要求是：便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。 二．基本设备配制 基本设备：冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。 灭菌设备：蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。 无菌操作设备：净化工作台、接种箱。 光温控制设备：时间程序控制器、空调及温度感应器。 细胞培养设备：培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床等。 细胞学鉴定设备：光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜。 三．培养器皿及实验用具 玻璃器皿 新型材料器皿 金属材质用具 四．洗涤技术 玻璃器皿洗涤：新购置的玻璃器皿，常有游离碱性物质，使用前，先用1%稀盐酸浸泡过夜，然后用洗衣粉洗涤，清水冲洗，晾干备用。已用过的玻璃器皿用洗衣粉刷洗，清水冲洗，晾干备用。 塑料用品洗涤：新的塑料器皿打开即用。已用过的塑料器皿冲洗干净，先用2%NaOH浸泡过夜，然后清水冲洗，再用2%—5%盐酸浸泡30min，清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗一遍，晾干备用。 金属用品洗涤：新的金属器皿用热洗衣粉水洗净，冲洗后擦干即可。 五．灭菌、消毒技术 物理方法：物理灭菌 干热、湿热、射线处理、物理除菌、过滤、离心沉淀等； 化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌。 1．培养基灭菌：利用常规的消毒灭菌方法，即高温高压湿热灭菌法，保持压力在9.8×104—10.8×104Pa、温度在121℃，灭菌20—30min； 2．玻璃器皿灭菌：可利用蒸汽高压消毒灭菌或干热消毒灭菌； 3、塑料器皿灭菌：多采用高压蒸汽消毒灭菌； ．金属用具灭菌：一般采用灼烧灭菌，即将其浸入95%酒精中，然后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用。应注意，在操作期间需多次对各种器械进行灼烧灭菌。 ．接种室灭菌：接种前，用紫外灯照射40min进行空气的消毒灭菌。对接种用的超净工作台，每次接种前用紫外灯照射40min左右，同时用70%—75%的酒精擦洗，然后进行培养材料的接种。 ．外植体灭菌：先用流水冲洗10—20min或更长时间，然后在70%酒精中浸泡30s，再立刻放入0.1%—0.2%氯化汞液中浸泡10min左右或在10%的次氯酸钠、饱和飘白粉浸泡30min左右，然后再用蒸馏水冲洗4—5次，即可。 六、无菌操作 —75%的酒精擦拭工作台和双手。 5、用沾有70%—75%酒精的纱布擦拭盛培养基的培养器皿，放进工作台。 6、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。 7、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。 8、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到。 9、取下接种器械，在火焰上消毒。 10、把培养材料放入培养瓶，盖上瓶口。 11、接种结束后，清理和关闭超净工作台。 注意：操作期间应经常用70%—75%的酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。 第二节 组织培养所需的环境条件及营养成分 一、所需环境条件 与自然条件一样，组织培养中的材料的生长要受到温度、光照、湿度等各种物理条件，不同气体、培养基的组成、pH值和渗透压等各种化学条件，以及外植体部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的影响。如何根据需要来控制培养条件是组织培养中的一个重要问题。本节主要阐述理化条件对培养生长的影响。 温度 温度是组织培养成功的关