HE石蜡切片步骤,免疫组化步骤.docVIP

HE染色 1．取材 切取的组织块不宜太大，以固定剂穿透，通常以mm×6mm×5mm为宜。2．固定 将切好的组织用生理盐水组织洗，立即投入固定液中固定，固定3。 水分洗涤 材料经固定后,脱水 80%、90%、0%、0%各级乙醇溶液脱水各0min 注意事项： （1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收气中80％的酒精×小时95％的酒精×小时100％的酒精×小时×2100％的酒精×5．透明 纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯（至透明为止）湿气6．透蜡 放入二甲苯和石蜡各半的混合液min，再放入石蜡、石蜡透蜡分钟。 保持包埋 包埋时，用镊子夹取从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入材料排列整齐切片 将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。 将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。 摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。 调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。 调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为410微米。 一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以4050r/min。 切成的蜡带到2030cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。 用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。 切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。 贴片40-45℃，另准备30%乙醇溶液。 切片时，将一碗30%乙醇溶液放于切片机旁的桌面上。 ② 用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在水面上小镊子脱蜡复水石蜡切片经脱蜡、脱蜡各min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%各级酒精溶液中各5min，再放入蒸馏水中3min。 11染色 切片放入苏木精中染色约1030min。12．水洗 用自来水流水冲洗约15min。使切片颜色蓝（或放入碱性水中也可），但要注意流水不能过大，以防切片脱落。 13分化 将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色，约秒至数十秒钟见切片变红，颜色较浅即可 14．漂洗 切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。15．脱水 切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各5min。 16、复染 用0.5%伊红乙醇液对比染色min。17．脱水 将切片放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中35min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。 18透明 切片放入二甲苯、中各5min。19．封藏：中性树胶封存 切片经二甲苯透明，树胶作为封藏剂，树胶可用二甲苯稀释至合适的稠度。 染色结果：细胞核被苏木素染成蓝色，细胞质被伊红染色呈粉红色。 1. 石蜡切片，步骤同前。切片经贴片后，60℃烤片30min使蜡熔化，经二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min,脱蜡。然后，将切片放入100%、95%、90%、80%、70%乙醇中3-5min，再放入蒸馏水中3min，水化。 2．脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4，具体看所用抗体及染色试剂说明)冲洗3次，每次3分钟。洗瓶冲洗。 3. 根据抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。可选步骤，具体见抗体说明书。 4.每张切片加1滴或50μl 3%过氧化氢，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分钟。此步骤是对内源性过氧化物酶含量高的组织而言。 4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl的第一抗体，室温下孵育60分钟或4℃过夜，具体参见每种抗体的说明书。PBS冲洗3次，每次3分钟。 5. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl 即用型MaxVisionTM 试剂或SP试剂，室温下孵育10-15分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。 6. 除去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3-5分钟（DAB）或37℃环境下10-30分钟(AEC)。 7. 自来水冲洗，苏木素复染10分钟，PBS或自来水冲洗返蓝。如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，步骤同H-E染色，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。