基因组DNA抽提操作流程.doc

基因组DNA抽提操作原理与意义 先用细胞裂解液对已制备好的组织匀浆充分裂解，然后用蛋白酶去除其中的蛋白，再用氯仿一次抽提（无需用酚抽提）、预备液沉淀、RNase去除RNA、乙醇再沉淀即可得到完整DNA。该方法适用于从人或动物的各种组织、血液、培养细胞、G+/G细菌中快速抽提基因组DNA。抽提出来的DNA能用于几乎所有的分子生物学实验，如DNA梯度分析、PCR、限制性内切酶反应、克隆、Southern Blot分析等。 试剂及其配制 TE缓冲液：PH8.0，由10 mM Trisl和1 mM EDTA配成。 RNase A（3 mg）：使用前加入300 μl无菌双蒸水，煮沸10 min后使其自然冷却后使用，20 ℃冻存。 Proteinase K（12 mg）：使用前加入600 μl无菌水，分装成小份，20 ℃冻存。 Cell Lysis Solution与Precipitation Solution：溶液出现絮状沉淀50 ℃加热溶解后使用。 1.2 mol/L NaCl。冰冷乙醇和氯仿自备。 实验器材 水浴锅、普通冰箱、1.5/2 ml离心管、移液器及枪头、紫外分光计、离心管架、剪刀、镊子、滤纸等。 操作步骤 组织匀浆制备：取30 mg左右新鲜组织，加600 ?l TE缓冲液，手工匀浆数次。 细胞裂解：吸取300 μl匀浆加600 μl Cell Lysis Solution，混匀。 消化蛋白：再加入9 μl Proteinase K(可适当增加)混匀，置于55 ℃水浴30 min以上（可达2.5 h），其间上下混匀几次。 氯仿抽提：加入600 μl氯仿（用户自备），轻柔上下混匀，不能太剧烈，以保证DNA的完整性。 沉淀：在台式离心机上，10000转/分，室温离心2 min。此时应分成三层，基因组DNA在上层中，如未能分层，表明样品与氯仿未混匀（可通过延长离心时间或增加离心速度获得上清）。取500 μl上清液，置于无菌1.5 ml离心管中，加入500 μl Precipitation Solution，混匀多次至出现状物，室温静置2 min。10000转/分，离心2 min。 去除RNA：弃除上清，注意不要倒掉沉淀，立即加入100 μl 1.2 mol/L NaCl，轻轻振荡直至DNA样品完全溶解，加入3 μl RNase A，置于37 ℃ 10 min，以去除RNA。 沉淀DNA：加入300 μl冰冷乙醇（终浓度为75％，沉淀效果最佳），－20 ℃放置10 min。10,000转/分，离心2 min。倒掉乙醇，倒置室温干燥10～15 min。若DNA量多，可再重复沉淀一次。DNA用TE缓冲液或100 μl三蒸水溶解。 注意事项 应避免多次冻融样品，因为每次冻融都大大降低完整DNA的产率。 加氯仿充分混匀，若离心后上清不到500 ?l，可适当延长离心时间或增加离心速度。 吸取DNA上清时，可用剪刀稍剪枪头尖部，以防止虹吸现象。 操作步骤中许多数值变，如上清与预备液按11，氯化钠与无水乙醇按13等。 转录活性很高的组织或细菌中通常含有大量的RNA，他们可能与DNA一起被分离出来。RNA的存在并不影响PCR反应。如果需要制备RNA-free的基因组DNA。可在第6步加入200 μl的RNase A，37 ℃保温10 min即可。 用分光光度计测量DNA含量按1 OD260=50 mg基因组DNA；进行0.7%琼脂糖凝胶电泳判定DNA的完整性，也可以判定样品中是否有RNA。本试剂盒可抽提长抵达50kb以上的DNA。 通常50μl体系PCR反应中用1～5 μl DNA。 1