凋亡检测操作流程一、AnnexinV检测凋亡细胞膜的改变.PDF

凋亡检测操作流程 一、Annexin V 检测凋亡细胞膜的改变 试剂及溶液： A ．对于单独购买的试剂： a) 10X Binding Buffer （货号：556454 ）：0.1 M HEPES ，pH 7.4；1.4 M NaCl；25 mM CaCl 2 。使用前稀 释至1X。 b) Propidium Iodide （PI，货号：556463 ）：建议与以下试剂同时使用Annexin V-FITC （货号：556420, 556419 ）或Annexin V-Biotin （货号：556418，556417 ） c) Via-Probe™ （货号：555816 ）：核酸染料7-AAD 。建议与以下试剂同时使用Annexin V-PE （货号： 556422，556421 ）或Annexin V-Biotin （货号：556418，556417 ）。 d) 1X PBS Buffer （货号：554781 ）：8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na HPO • 7H 0, 0.24 g KH PO , 加水至 2 4 2 2 4 1L。调整pH 值至7.2 。高压灭菌室温保存。 B．对于凋亡检测试剂盒（货号：556547 ） a) FITC Annexin V （组分编号：51-65874X ）：每个样本5 μl 用量。 b) Propidium Iodide （PI，组分编号：51-66211E) ）：现成的核酸染料。每个样本5 μl 用量。 c) 10X Annexin V Binding Buffer （组分编号：51-66121E ）：0.1 M Hepes/NaOH (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2.使用时用双蒸水配制成1X。 操作步骤： 1．取Falcon 试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。 6 2 ．使用冷的PBS 缓冲液洗细胞两次，再用1 Binding Buffer 缓冲液制成110 细胞/ml 的悬液。 3 ．Falcon 试管中加入100 µl 细胞悬液。 4 ．按以下体积加入Annexin V 与核酸染料： 管号 名称 荧光标记Annexin V 核酸染料： 1 阴性对照 - - 2 单阳1 AV-FITC - 3 单阳2 - PI 4 样本 AV-FITC PI 5 ．轻轻混匀，室温（20C ~25C ）避光处放置15 分钟。 6 ．*使用Annexin V-Biotin 试剂进行检测时：  1Binding Buffer缓冲液洗细胞一次，去上清。  1Binding Buffer缓冲液100µl溶解SAv-FITC试剂0.5µg ，加入到细胞管中。  轻轻混匀。加入5µl PI，室温（20-25C ）避光处放置15分钟。 7 ．各试验管中分别加入1Binding Buffer 缓冲液400µl。1 小时内上流式细胞仪测定结果。 Annexin V Blocking 待测细胞与未标记的重组Annexin V 预孵育，然后进行实验，是Annexin V 细胞凋亡检测的质量控制。 原理是预先阻断Annexin V-FITC 的结合位点，这样可以证明Annexin V-FITC 凋亡分析的特异性。 6 1.