MDCK细胞微载体悬浮培养放大工艺研究.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（９）：５５６０ ＭＤＣＫ细胞微载体悬浮培养放大工艺研究  龚　迪　易小萍 　张元兴 （华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室　上海　２００２３７） 摘要　ＭＤＣＫ细胞对各种流感病毒具有高度敏感性，广泛应用于流感病毒的分离和疫苗制备。通 过探索培养基中促进细胞贴壁的关键组分，并筛选水解物，开发了适合ＭＤＣＫ细胞生长的低血清 培养基。发现钙、镁离子是细胞贴壁不可缺少的物质，麦麸水解物可以部分代替培养基中的血 清。利用该低血清培养基，经过消化转移将ＭＤＣＫ细胞从５Ｌ反应器放大至２５Ｌ反应器，微载体 ５ 上细胞贴附均匀、生长旺盛，２５Ｌ反应器中培养４８ｈ细胞密度可达３０．５×１０ｃｅｌｌｓ／ｍｌ。研究结果 为工业规模反应器微载体悬浮培养ＭＤＣＫ细胞生产流感病毒奠定了基础。 关键词　ＭＤＣＫ细胞　微载体　低血清培养基　消化放大 中图分类号　Ｑ８１３ 　　２１世纪初以来禽流感疫病频发，给包括我国在内 养基ＭＬＳＭ，在此基础上通过微载体消化技术实现了５ 的多个国家造成了严重的经济损失，并有可能进一步 Ｌ反应器到２５Ｌ反应器的放大培养，并且研究了放大 扩散。而人感染禽流感病例的出现更让各国政府加大 过程中ＭＤＣＫ细胞生长和代谢的特征，为更大规模的 了对禽流感疫病防治的关注和投入。疫苗免疫是预防 反应器微载体悬浮培养ＭＤＣＫ细胞生产禽流感病毒奠 禽流感大规模爆发的有效手段。禽流感疫苗的传统制 定了基础。 备方法是用鸡胚作为基质生产病毒，存在外源病毒污 ［１］ １　材料与方法 染、疫苗批次间差异大、鸡胚难以大量供应等缺陷 。 随着国内动物细胞培养技术的不断进步和推广，用 １．１　材　料 ＭＤＣＫ细胞培养来生产禽流感病毒已是必然趋势。 　　犬肾上皮细胞系ＭＤＣＫ（ＭａｄｉｎＤａｂｙｃａｎｉｎｅｋｉｄｎｅｙ 　　微载体悬浮培养是目前先进的贴壁型细胞培养技 ｃｅｌｌｓ）细胞购 自中国科学院细胞库，实验室传至第 术，近年来国内也有用此技术培养 ＭＤＣＫ细胞生产禽 ７０代。 流感病毒的文献报道。但国内的研究一般需要在培养 　　ＭＥＭ培养基和新生牛血清（ＮｅｗＢｏｒｎＣａｌｆＳｅｒｕｍ） 基中添加１０％血清，这给下游纯化带来很大压力，产品 购自Ｇｉｂｃｏ公司；麦麸水解物、酵母水解物购自Ｋｅｒｒｙ公 质量不易控制，若血清去除不干净还会使免疫动物发 司；微载体Ｃｙｔｏｄｅｘ１购自ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ公司；其他试 生剧烈过敏反应。如果采用商业化无血清培养基，对 剂均为进口或国产分析纯产品。 于利润微薄的动物疫苗企业来说，大量采购商业化无 　　５Ｌ和２５Ｌ生物反应器，溶氧（ＤＯ）和ｐＨ由空气、 血清培养基无疑大大提高了生产成本，降低了企业的 氮气、氧气和二氧化碳四气控制。 市场竞争力。目前，国内ＭＤＣＫ细胞反应器微载体培 １．２　低血清培养基的开发 ［２］ １．２．１　考察钙、镁离子对细胞贴壁的影响　实验在细 养研究一般只是单批次的培养 ，至今还没有文献报 道反应器微载体系统ＭＤＣＫ细胞消化放大工艺的相关 胞培养平皿中分别考察了钙、镁离子对细胞贴壁的影 研究。 响，其中钙离子浓度为 １．４５ｍｍｏｌ／Ｌ，镁离子浓度为 ５ 　　本文自主开发了适于ＭＤＣＫ细胞生长的低血清培 ０．７