感受态细胞转化操作步骤12.8.docVIP

感受态细胞转化 （一）实验准备： 1.Amp母液： 称取氨苄青霉素100mg溶于1ml dd H2O中。0.22μm滤器过滤除菌，用EP管分装后储存于-20℃冰箱. 2.X-Gal溶液（2%，m/v） 称取20mg X-Gal溶于1ml二甲基甲酰胺（DMF）中。用玻璃试管或聚丙烯管分装后储存于-20℃冰箱,装有X-Gal溶液的试管须用铝箔包裹以防因光照而被破坏.（无须过滤） 3.IPTG（20%,m/v,0.8mol/L） 称取IPTG2g溶于8ml dd H2O中。用蒸馏水定容至10mL。0.22μm滤器过滤除菌，用EP管分装成1mL一小份后储存于-20℃冰箱. （二）操作步骤“ 质粒pBS SK(-)的转化 1.取感受态细胞置于冰浴中，待感受态细胞融化后，分别在100μl感受态细胞悬液中加入下列DNA质粒或水，轻轻摇匀后冰上放置30分钟。 ??感受态细胞+pBS SK(-)质粒2μl (含量不超过50ng,体积不超过10μl) ??感受态细胞+无菌水2μl （阴性对照） 2. 热击：42℃水浴中热击90秒（注：精确计算时间，过长将对细胞造成伤害）,热击后立即置于冰上冷2-5分钟（禁止摇动）。 3. 复苏：向每管中加入400μl LB液体培养基(注：不含Amp),混匀后37℃轻摇培养1~1.5小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。 涂布平板筛选转化质粒 方法一（《分子克隆实验指南》标准方法） 将溶化的顶层琼脂分装于17*100mm试管，将试管置于45℃的加热块槽内备用。 （90mm培养板用3mL顶层琼脂；150mm培养板用7mL顶层琼脂） 2．从加热块取出一支试管，快速加入活菌含量不多于3000（90培养基）或10000（150培养基）的细菌悬液0.1mL。盖紧试管盖颠倒数次。以使细菌在琼脂中混匀。 3.按下表加入： 培养板 尺寸 试剂用量 溶化态顶层琼脂 X-Gal IPTG(如果需要) 90mm 3mL 40ul 7ul 150mm 7 mL 100ul 20ul 4. 快速将溶化的顶层琼脂倾入含有适当抗生素的凝固琼脂板的中部，旋转培养板使琼脂散匀。 .注：含Amp的LB固体培养基倒板 (1)配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉 (2)抗生素的加入：高压灭菌后，应使培养基降温至50℃，方可加入Amp，按每100ml培养基加10mg/ml Amp溶液1ml，使其终浓度为100μg/ml（但是也有人认为Amp浓度为50—100ug/ml）， (3)倒板：在超净台上铺平板，90mm直径的培养皿约需25ml培养基。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。 5．于室温使琼脂凝固，擦净培养板盖上的冷凝水，颠倒培养板于37℃培养12-16h. 6.取出培养板于4℃放置数小时使菌落显色。 7.鉴定携带重组质粒的克隆 1).携带野生型质粒的克隆含有β-半乳糖苷酶活性，菌落的中央呈淡蓝色，外周成蓝色。 2). 携带重组质粒的克隆含有β-半乳糖苷酶活性，菌落呈奶白色，有时会在菌落中央出现假性蓝斑. 8.筛选和培养携带重组质粒克隆. 软琼脂中蓝色或白色克隆可在不同方向上形成,不管其方向性,这些克隆很容易用接种环或牙签通过穿刺琼脂浅层而被挑选出来,并转移至含有抗生素的培养基中. 方法二（《分子克隆实验指南》备用方法） 1在含有适当抗生素的预制90mm琼脂板（LB或YI）中央滴加40uL2%X-Gal和7uL20%IPTG(如有必要) 2.用一个无菌的涂布器（或一个弯曲而顶口已用火焰封闭的巴斯德吸头）播洒X-Gal溶液，使之分散于培养板表面。于37℃温浴至全部液体消失。 （由于二甲基甲酰胺的挥发性低，如用新鲜琼脂板这一过程要持续3-4h。） 3接种需要鉴定的细菌，可以用接种环划线，也可以用牙签挑取克隆，或用细菌悬液（50000个细胞/mL）铺板，90mm板用100ul悬液。 4．颠倒培养板于37℃培养12-16h. 5.取出培养板于4℃放置数小时使菌落显色。 方法三 IPTG,X-Gal,AMP培养基 1.在100ml的琼脂培养基中，加入200ulX-Gal（2%）,100ul的Amp和100ulIPTG（20%）,制成培养基。 2.倒板后打开盖子，在紫外下照10-15分钟。 3. 接种需要鉴定的细菌，可以用接种环划线，也可以用牙签挑取克隆，或用细菌悬液（50000个细胞/mL）铺板，90mm板用100ul悬液。 4．颠倒培养板于37℃培养12-16h. 5.取出培养板于4℃放置数小时使菌落显色。 次日（12-14小时后）观察和计算转化率：观察记录转化情况并统计转化率。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：