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免疫组化入门实验操作 一、实验目的： 了解免疫组化基本原理。 了解免疫组化实验操作及注意事项。 免疫组化结果判定。 通过实验，让学生熟悉对进行研究。要求学生通过查阅文献，在归纳、对比、总结的基础上 三、实验材料： 一抗：CD5、CK8、Ki67 二抗： MaxVision3 其它：柠檬酸抗原修复液、过氧化物酶阻断剂、PBS缓冲液、DAB、孵育盒、染色架、苏木素、盖玻片、冲洗瓶、中性树胶，孵育盒。 四、实验步骤： 脱蜡水化 二甲苯5min，二甲苯5min，二甲苯5min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，95%酒精2min，85%酒精2min，自来水冲洗。 抗原修复 高压锅中加入1200mL柠檬酸修复液，电磁炉煮沸后放入切片，扣紧锅盖，功率调至800W，至压力阀均匀喷气后计时1.5min，移开高压锅室温冷却10min，自来水冷却。 过氧化物酶阻断 修复结束后，流水冲洗干净，除去自来水，在离组织3mm处用免疫组化油笔画圈或用纸巾擦干组织外残留的液体，滴加50 μL（一滴） 过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min，PBS冲洗3×3min。 一抗 甩去PBS，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）相应一抗，室温下孵育60分钟，PBS冲洗3×3min。 二抗 甩去PBS，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）MaxVisionTM试剂，室温下孵育30分钟，PBS冲洗3×3min。 DAB 甩去PBS液，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）新鲜配制的DAB，显色5分钟，自来水冲洗。 苏木素复染 每张切片滴加50 μL（一滴）苏木素，20-30秒后自来水冲洗30s以上，或浸泡于PBS中30s以上再自来水冲洗。 封片 梯度酒精脱水干燥（85%酒精2min，95%酒精2min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，二甲苯1min），或直接电吹风吹干，中性树胶封固。 修复方法 柠檬酸缓冲液高温高压修复法 取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液（800-1500ml）于压力锅中，大火加热至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片至于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中。盖上锅盖，扣上压力阀，将功率调至800W,继续加热至喷气，从喷气开始计时，1.5分钟后，压力锅离开热源，室温冷却10分钟后用自来水冲淋高压锅外壁加速冷却至室温，取出玻片，自来水冲洗干净。 注意事项： 1、加热时间长短（1.5分钟）和加热功率（800W）的控制很重要，时间过短可能会使染色强度变浅，时间过长可能会使染色背景加深。 2、必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防缓冲液pH值增高而导致掉片。 3、高压锅离开热源后必须等缓冲液冷却后，才能把切片取出。 4、为防止组织脱落，必须使用防脱玻片。 5、缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到。 EDTA水煮修复法 取500mlEDTA抗原修复液于1000ml不锈钢锅中，加热至沸腾，将电磁炉功率调至保温状态（120W），使修复液保持微沸状态。将脱蜡水化后的切片置于耐高温染色架上，再将染色架缓慢放入不锈钢锅中（注意：若快速放入可能会导致组织脱落），之后加盖继续加热20分钟。再将不锈钢锅从电磁炉上移开，室温冷却10分钟后用自来水冲淋不锈钢锅外壁加速冷却至室温，取出玻片，自来水冲洗干净，除去自来水，在离组织3mm处用免疫组化油笔画圈，PBS冲洗2次，每次3分钟。 注意事项： 1、加热时间长短（20分钟）和加热功率（120W）的控制很重要 2、修复液不能重复使用。 3、工作液的量必须保证切片始终能浸泡在液体内。 4、为防止组织脱落，必须使用防脱玻片。 5、抗原修复后一定要等修复液冷却后，才能将切片取出。 石蜡切片制作和HE染色 一、目的要求：简要介绍石蜡切片的制作和苏木精、 曙红染色法（简称H.E染色法）， 借以了解石蜡切片制作的基本原理和一般方法。 二、实验用具：解剖器一套、单面刀片、切片刀、切片机、载玻片、盖玻片、标本瓶、烧杯、量筒、漏斗、染色缸、树胶瓶、酒精灯、毛笔、绘图纸、滤纸、熔蜡箱（或恒温箱）、展片台（或烫板）、小木块、蜡带盒、烤片盒、切片托盘。 三、实验材料：蛙或小白鼠。 四、实验内容： （一）药品： １、７０％、８０％、９０％、９５％酒精及无水酒精： ９５％以下的各级浓度酒精是用９５％酒精加蒸馏水稀释而成。简单的稀释方法：所需稀释的浓度是多少，就量取多少毫升原浓度的酒精，再加蒸馏水至该酒精的原浓度即可。例如，配制７０％酒精，就量取７０ml９５％酒精，然后加入２５ml蒸馏水即成。 ２、固定液： 　常用的固定液有１０％福尔马林、Bouin氏液和Zenker氏液等。Bouin氏液在组织学切片技术方面应用甚广，配方如下： 　苦味酸饱和