CLSM CPU WYF 激光共聚焦扫描显微镜.pdf

激光共聚焦扫描显微镜 （0841207 汪亦凡） 激光共聚焦扫描显微镜(CLSM 或LSCM)是一种可以用高灵敏度的方法获得高分辨率光 学图像的技术。聚焦显微镜最显著的特征是能够从光学分组过程中的特定深度中获得聚焦图 像，图像以点对点的方式获得并在允许与复杂空间地形物体的三维重建的条件下联机。 一 历史起源 聚焦显微镜的原理在1957 年由Marvin Minsky 首次提出，但是在十九世纪八十年代末 期又用了三十年的时间使CLSM 激光器得以发展并成为一种标准技术。在1978 年Thomas a 和Christoph Cremer 设计了一种激光扫描过程，能够在聚焦激光光束的条件下以点对点的方 式扫描三维物体的表面，并通过类似于电子扫描显微镜的方法产生完整图像。 这个 CLSM 的设计将电子扫描方法首次与荧光染色的生物物体以三维检测的方法相连 接。在接下的十年里，聚焦荧光显微镜被发展成为一种完全成熟的技术，尤其是在 Amsterdam 大学和欧洲分子生物学实验室（EMBL ）的工作下完成的。 二 技术特点 （1）多线性氩激光: 458nm, 488nm, 515nm 长期激光二极管: 405nm, 559nm, 635nm （2 ）全息光栅成像技术（2nm 光谱波长分辨率，线性光谱分布） （3 ）光谱成像：具可调带宽的双检测器（加一标准检测器）；透射光检测器明场或DIC 成像 （4 ）SIM 扫描仪在405nm 下高时间分辨率的光活化或光漂白 （5 ）荧光带宽: 1～100nm 光谱扫描范围: 400～800nm 显然，聚焦显微镜相对于传统的光学显微镜具有优势，包括，视野深度的可调性，去除 离焦图像信息，从大样品中筛选连续光学组成。聚焦方法的关键是使用空间过滤去除比聚焦 平面厚的离焦光线或火焰。近几年聚焦显微镜被广泛使用，很大一部分的原因是容易从样品 中获得极高质量的图像，以及目前在各个研究领域的广泛应用。 三 成像原理 在聚焦激光扫描显微镜中，激光束通过光源孔并被物镜在样品的内部和表面聚焦到一个 小的（衍射极限）聚焦器中，尤其在生物应用中，样品有可能是荧光的。散射或折射的激光 还有来自亮点的荧光被物镜重新收集。分光器将光拆分到检测器中，它将在荧光聚焦显微镜 中发生过滤，选择性的通过荧光波长但阻碍原来的激发波长。通过针孔以后光强被光检测仪 器检测到（通常为光电倍增管），将光信号转为由计算机记录的电信号。大部分返回光被针 孔阻挡产生比传统荧光技术更清晰的图像，并可以得到样品内各个深度的平面图像。 从检测到的光线照射在标本来源地代表一个体积元在生成的图像的像素。当激光扫描目 标平面时，整个扫描得到的图像被像素对像素的形式获得，而产生的图像的一个像素的亮度 相当于检测光线的相对强度。通过使用震荡镜使光束在水平面内扫过样品。这种扫描方法通 常具有较低的反应潜伏期和扫描速度可以不同。较慢的扫描提供了一个更好的信号与噪声的 比例，导致更好的对比度和更高的分辨率。信息可以从不同的焦平面收集通过提高或降低阶 段或显微镜物镜。通过计算机可以生成装配这些二维图像堆栈连续焦平面一个标本三维图 像。 四 应用 CLSM 在众多生物科学学科中被广泛应用，从细胞生物学，遗传学到微生物学和发展生 物学, 甚至在其他科学中得到应用。 （1）冻融组织中的微观结构 生物组织冻结和解冻是超低温保存及冷冻基本现象。在这项研究中，这种激光共聚焦显 微镜染色的实时三维观测方法应用于鉴别在冻结的冰晶体和三维成型和细胞生物组织解冻。 新鲜白鸡肉（肌肉组织）被用来作为物质，以吖啶橙为染料。冻结形式，该组织中冰晶的形 态，并与细胞间的冰晶相互作用以两种不同的热效应进行了研究。将结果进行了比较，并与 观察的冻结和解冻组织病理变化相关。 以下显示了由于冻结和解冻产生的组织变化。（MF-肌肉纤维，CT-细胞质） （a ）在冷冻前，肌肉组织连接紧密并成有序分布。 （b ）在缓慢冷冻和快速加温过程中，外细胞冷冻效应明显。肌肉纤维萎缩并变形，期间分 布大的裂隙。 （c ）相比较而言，在快速冷冻和快速加温过程中，外细胞冰晶效应明显。许多小二细微的 裂隙出现在肌肉纤维中。 （2 ）终端绒毛血管在正常和先兆子痫胎盘中的研究 终端的绒毛膜绒毛血管在怀孕中起着举足轻重的作用，因为胎儿的营养代谢和所有的母 胎营养交换