cDNA测序和表达谱研究课件.pptVIP

cDNA测序和表达谱研究 一、cDNA测序 cDNA：与信使RNA互补的DNA，代表了基因的生物学信息。 基因：约占总序列的3％-5％ 1991年，Venter等： 提出大规模cDNA测序研究战略 建立了表达序列标签(expressed sequence tag，EST)技术。 EST： 长度为300～500bp的部分cDNA 对人类基因转录图的制作、全长基因的克隆、基因表达谱的研究等有重要作用。 公共数据库GenBank(／dbEST) UniGene： 为了弄清EST间的关系，美国国立生物技术信息中心(NCBl)根据EST相似性比较进行聚类分析，形成数据库UniGene (／UniGene) 当前cDNA测序的趋势: 由对EST的随机测序， 转向全长cDNA的克隆和测序。 全长cDNA 是功能基因组学和比较基因组学研究的基础， 有功能意义的全长cDNA可以申请专利， 因此，除研究部门外，大药厂和生物技术公司也投入重金进行研究和抢占专利。 目前大部分的全长基因有待于克隆。 随着人类基因组DNA测序的快速进展，众多EST可供利用，生物信息学手段的增多和cDNA文库构建技术的完善，使得能够获得转录物较长的全长cDNA和低转录基因。 目前，美国NIH启动了全长cDNA计划—哺乳动物基因采集计划(Mammalian Gene Collection Project) ，加之其他国家的加入，大大加快了全长cDNA的识别和克隆工作。 中国的人类基因组计划起步较晚，但坚持“有所为，有所不为”的原则，充分利用自己的资源优势和研究基础，提出对特殊组织如造血细胞、神经内分泌细胞、树突状细胞、胚胎器官等,或疾病如白血病、肝癌等进行大规模EST测序,进行基因表达谱分析，同时完成1％人类全长cDNA的识别和克隆任务。 (一)大规模EST测序流程 并非简单个别cDNA测序的累加， 是现代生物技术和现代管理方法的结合， 是生物学与计算机科学的结合。 大规模EST测序： 多采用流水线作业及计算机辅助管理系统。 主要步骤： 1)cDNA文库构建 2)DNA测序 3)信息处理和管理 4)生物信息学分析 1. cDNA文库构建 研究目的不同—采用不同的cDNA文库构建方法。 ①表达谱分析：常规的cDNA文库，如：oligo-dT引物定向克隆cDNA文库或随机引物法构建cDNA文库； ②获得更多的全长cDNA：构建全长cDNA文库，如：smart-PCR和oligo-PCR； ③增加EST种类：均一化(normalized)cDNA文库； ④克隆不同状态(药物处理的不同时相、不同病理及疾病的不同发展阶段等)的相关基因：减式cDNA文库构建方法。 (1)oligo-dT引物定向克隆cDNA文库 最常用、大多数cDNA文库构建的方法； 多数EST来自该文库。 主要步骤： RNA和mRNA抽提， 以mRNA为模板用oligo-dT作反转录引物合成 cDNA第一链， 在DNA聚合酶I作用下合成第二链， 加上接头后定向装入λ噬菌体。 (2)CapFinder-PCR/oligo-PCR文库 主要特点： 利用mRNA 5’帽状结构设计引物， 该引物含有oligo(G)以对应于帽状结构的脱氧胞嘧啶，反转录反应时易于合成含有全长的第一链cDNA， 用5’和3’引物(oligo-dT)进行PCR扩增获得双链DNA， 装入λ噬菌体。 该种文库含有较高比例的全长cDNA， 也适于样本量较少的组织构建cDNA文库。 (3)均一化cDNA文库 特点：将低丰度表达基因识别和克隆出来 各个实验室所采取的具体方法不同，效果也不一致。 主要目的： 减少测序量，尽可能识别更多的基因尤其是低转录基因。 构建文库时： 通过控制PCR反应减少高丰度基因扩增， 或采用自身mRNA乳胶吸附方法减少高丰度mRNA； 构建cDNA后， 也可以通过杂交的方法去除部分高表达的基因， 或者通过循环杂交、吸附的方法去除已经测序基因。 (4)减式cDNA文库 根据研究目的，可采用不同的减式方法。 如要获得药物处理后上调的基因， 采用前向(forward)减式方法，即用药物处理前mRNA杂 交或吸附药物处理后的mRNA； 反之，要获得药物处理后