口腔上皮基因组DNA及鉴定.docVIP

海南大学农学院09级生物科学专业 许连华 20090110310061 人口腔上皮细胞提取基因组DNA及PCR-RFLP法鉴定CYP2C9基因 一 实验目的 1、练习酚-氯仿法提取人的基因组DNA 2、掌握PCR法分离全基因组中特定基因的原理和方法 3、熟悉RPLF法鉴定遗传多态性并掌握其鉴定基因型的原理 二 实验原理 1、酚-氯仿法抽提基因组DNA的原理 在EDTA存在下，用蛋白酶K消化细胞，用去垢剂溶解细胞膜，用酚抽提，除去杂蛋白、RNA及其他大分子，用异丙醇或乙醇沉淀可得到口腔上皮基因组DNA。 2、PCR法分离基因的原理 PCR即聚合酶链式反应的原理类似于DNA的天然复制过程。在带扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，DNA聚合酶以单链DNA为模板利用反应体系中的dNTP,按5′→3′方向经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n。 3、RFLP的原理 RFLP即限制性内切酶片段多态性是基因型之间限制性片段长度的差异，是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变引起的。 CYP2C9是细胞色素P450超家族的成员之一。是一类主要存在于肝脏、肠道中的单加氧酶，催化多种内外物质的代谢。目前约有16%的临床药物由CYP2C9负责代谢。CYP2C9具有高度的多态性。T269C是位于CYP2C9基因第二外显子的一个多态位点。 中国人群中大多数是纯合子，可被EcoRⅡ内切，内切位点（CTC/A）GG387bp+302bp(GAC/T)CC;少数CYP2C9产生突变。突变T269C，CCTGG突变为CTTGG，EcoRⅡ内切产生三条片段192bp+195bp+302bp。本实验利用RFLP酶切技术检测CYP2C9的基因型。 三 实验器材与试剂 1、器材 1.5ml离心管，系列移液枪，消毒棉签，恒温水浴锅，台式离心机，电泳系统，PCR仪 2、试剂 人口腔上皮细胞，裂解液（150mM EDTA PH8.0 950ul+10%SDS 50ul）dNTP Mgcl2 PF PR Taq酶 ），Marker，酶切体系（10×buffer Bci130I）。 四 实验步骤 1、口腔上皮细胞基因组DNA提取 ①取1.5ml离心管，加入1ml裂解液（50mM EDTA PH8.0 950ul+10%SDS 50ul） ②取消毒棉签在漱口后的擦刮，放入1ml裂解液中洗脱 ③加入20mg/ml蛋白酶K2.5ul，混匀，56°C水浴2h ④取新的1.5mlEP管加入300ul酚，300ul氯仿/异戊醇（24:1） ⑤取800ul上述裂解反应液加入④试剂中 ⑥颠倒混匀，750g离心15min ⑦取上清，加入30ul 5M Nacl 和700ul氯仿/异戊醇 ⑧颠倒混匀，7500g离心15min ⑨取上清，加入0.6倍体积异戊醇，1200g离心15min，弃上清 ⑩70%冷乙醇洗涤沉淀，7500g离心5min，弃上清，干燥。加15ml水溶解，并电泳检测。 2、CYP2C9基因的PCR扩增 ①PCR扩增 总体系：25ul H2O 10×buffer dNTP （2.5mM） Mgcl2 (25mM) PF (1OuM) PR (1OuM) Taq酶 (5U/ul) DNA 15.5ul 2.5ul 2ul 1.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul 2ul ②电泳检测 1%凝胶电泳检测。样品与marker上样量各为5ul 3 、CYP2C9限制性长度多态性分析 进行限制性内切酶酶切，酶切体系：2ul 10×buffer ,0.5ul 10M/ml BciT130I,17.5ul PCR产物。体系总体积为20ul 酶切1h,37℃水浴。 4、电泳检测 电泳体系为：2%凝胶，maker5ul。 五 实验结果 本小组为第五实验组。 基因组DNA第一次电泳检测。 上下两排第一条带均为Mark。每个实验小组点两个点样孔，从上排到下排，左到右一次点样。第五组点样在下排，第五组电泳条带显示第五组基因组DNA提取失败。其中，第一组，第二组，第三组，第六组均显示条带，说明基因组DNA提取成功。每排靠近点样孔处的亮点可能是杂蛋白或者其他杂质成分。 CYP2C9 PCR扩增电泳图 上下两排第一条带均为Mark。电泳点样同基因组DNA电泳电泳顺序。由于基因组DNA提取失败，PCR也因此扩增失败。其他个别实验组扩增成功，显示亮条带。除了PCR条带外，还显示了其他亮条带，可能是引物二聚体或其他杂质成分条带。 CYP2C9酶切电泳图 上下两排第一条带均为Mark。酶切电泳点样同以上两个电泳电泳顺序。本组实验失败。图中其他小组的电泳条带均显示为双条