流式细胞术分离法.docVIP

流式细胞术分离法 一实验目的 掌握流式细胞术分离T、B细胞的原理与方法。 二实验原理 流式细胞术（FCM）是一种对处在液流中的单个细胞或其他生物微粒等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新技术融为一体，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。 将荧光标记的单克隆抗体加入从外周血液中分离的单个核细胞悬液内，使二者特异性结合，通过流式细胞仪自动检测，即可很快的得到T、B细胞及亚群百分率和绝对值的有关数据，又能以每秒高达5000个细胞（18×106个细胞/h）的速度分离收集无菌的淋巴细胞，纯度可以达到90％~99％，细胞活性亦不受影响，可用于淋巴细胞的各种免疫生物学功能测定。 流式细胞仪由激光光源系统、气控单细胞层流系统、光检测及信息处理系统和细胞分离纯化系统组成。 工作原理为经过荧光抗体染色的单细胞悬液和鞘液在氮气压力下同时进入流室，形成鞘液包裹细胞悬液的稳定层流，由喷嘴高速射下（1000~5000个细胞/s），与垂直而来的激光束交汇。在混合细胞中，由于细胞大小、胞内颗粒多少及DNA含量等不同，使激光产生不同的散射，分别由散射光检测器接受；细胞上着染的荧光燃料在激光激发下，发射出荧光，由荧光检测器接收，所有信号自动传送入电子计算机分析处理，迅速获得细胞类群及其数量的信息。由高频超声振荡器和极向偏转板等构成的细胞分离纯化系统，在分析鉴别不同细胞类群的基础上，使带有不同电荷的细胞滴通过电磁场时发生偏离，最后将细胞分别收集于不同的容器内。 三实验器材 1器具 恒温培养箱、流式细胞仪、水浴锅、水平式离心机、离心管、冰箱、烘箱、吸管、滴管、微量加样器等。 2 材料 RPMI-1640、FITC-抗CD3单克隆抗体（FITC为异硫氰酸荧光素）、CD3为T细胞表面特有的蛋白质分子（分化抗原）、分离单个核细胞所需试剂。 四实验方法 1用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离单个核细胞，用RPMI-1640培养基配成1×107/mL。 2 加适量FITC-抗CD3单克隆抗体，4℃孵育30min，用RPMI-1640培养基洗两次。 3 用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光参数图上选取绿色荧光阳性的细胞群进行分选。 五注意事项 1分选细胞常常用于细胞亚群群的进一步功能研究，因此，整个过程均需严格的无菌操作，并且在进行流式细胞仪分选前应对流式细胞仪进行无菌冲洗。 2 此法分离得到的T细胞纯度可以达到99％，收获率可达到90％。 3 由于喷嘴孔径很小（约70~100μm），分选前需用30~40μm孔径的滤网过滤细胞悬液，以免细胞凝块堵塞喷嘴。