√7第四章-柠檬酸发酵机制_.ppt

柠檬酸发酵机制Fermentation Principal of citric acid 南方医科大学生物技术学院 College of biotechnology Southern Medical University 本章节主要内容 柠檬酸的主要用途 1.用于食品工业 2.用于化工和纺织业 3.用于环保 4.用于禽畜生产 5.用于化妆品 6.用于杀菌 7.用于医药 葡萄糖生成柠檬酸的全过程中，在碳平衡方面没有碳原子的损失，在乙酰CoA和草酰乙酸缩合时还从水中引进一个氧原子 2C6H12O6+3O2 2C6H8O7+4H2O 可见柠檬酸发酵对糖的理论转化率为106.7%，以含有一个结晶水的柠檬酸计为116.7% 二、柠檬酸生物合成的代谢调节 黑曲霉糖酵解及丙酮酸代谢的调节 Habison研究黑曲霉B60时发现，EMP途径中PEK是一种调节酶。 1981年，Rohr等通过比较糖酵解中间代谢产物浓度和各种酶的热力学平衡常数，确认产柠檬酸黑曲霉的PEK也是调节酶。 丙酮酸羧化酶和丙酮酸脱氢酶的平衡 * 1.柠檬酸生物合成途径 2.柠檬酸生物合成的代谢调节 3.柠檬酸发酵过程的控制要点 柠檬酸简介 柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。化学名称2-羟基丙三羧酸，英文文献俗名citric acid，分子式C6H8O7。无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。　　 1940年 1953年 1954年 1954-1955年 Jagnnathan证实黑曲霉中存在EMP途径所有酶 Shu提出葡萄糖80%经EMP途径代谢 Ramakrishman等发现黑曲霉中存在TCA循环。 Krebs: TCA 柠檬酸的生物合成途径 一、柠檬酸生物合成途径 丙酮酸羧化酶 丙酮酸脱氢酶 柠檬酸合成酶 黑曲霉糖质发酵柠檬酸 证明生产菌（黑曲霉）中80%的糖代谢走EMP途径 生产菌中存在TCA的酶系，故有TCA存在 草酰乙酸的来源不是由TCA供应，而是由2个CO2固定提供，故CO2固定对柠檬酸合成必不可少。 由于不存在苹果酸脱氢酶 柠檬酸主要产生菌：黑曲霉 Mg+ K+ PYR+CO2+ATP 草酰乙酸+ADP+Pi PEP+CO2+ADP 草酰乙酸+ATP PEP羧激酶 丙酮酸羧化酶 葡萄糖生成柠檬酸的碳平衡 葡萄糖生成柠檬酸的碳平衡和能量平衡 底物水平磷酸化 氧化磷酸化磷酸化 可以满足生产菌的维持能量消耗，不需要消耗C源经TCA来产能 为什么黑曲霉能够过量积累柠檬酸呢？ 公认，哺乳动物和酵母的PEK能调节酵解过程，此酶为EMP途径第一调节点。 那么黑曲霉呢？ 第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFK） Δ 柠檬酸和ATP对该酶有抑制 生产菌需要解除该抑制作用 Δ AMP、无机磷以及NH4+对该酶有活化作用 NH4+有效解除柠檬酸和ATP对该酶的抑制 ， NH4+浓度与柠檬酸生产速度有密切关系，正是细胞内NH4+浓度升高，使PFK对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。 故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量 磷酸果糖激酶 1. 糖酵解及丙酮酸代谢的调节 Δ Mn2+的影响： Mn2+缺乏 可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解 NH4+水平升高 减少柠檬酸对PFK的抑制 Mn2+缺乏 高糖 NH4+↑ Glu Gln Orn Arg 氨基丁酸 蛋白质和RNA转换过程中细胞蛋白的再合成受损伤 1. 糖酵解及丙酮酸代谢的调节 1. 糖酵解及丙酮酸代谢的调节 丙酮酸羧化酶 丙酮酸脱氢酶 2.三羧酸循环的调节 柠檬酸合成酶 顺乌头酸水合酶 异柠檬酸脱氢酶 α-酮戊二酸脱氢酶 柠檬酸合成酶是TCA循环第一个酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。 大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键。丙酮酸羧化酶 和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或其控制极 微弱，而且这两个反应的平衡保证了草酰乙酸的提供， 增加了柠檬酸的合成能力。 2.三羧酸循环的调节——柠檬酸合成酶 顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸------顺乌头酸正逆反应的酶，作用需要Fe2+。 （1）添加Fe2+络合物 （2）筛选该酶缺失或活力降低的菌株 （3）随着柠檬酸的积累，高酸环境可进一步造成顺乌头 酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活 2.三羧酸循环的调节——顺乌头酸水合酶 2.三羧酸循环的调节——NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶 黑曲霉中只有一种NAD-异柠檬酸脱氢酶，且活力很低。 NADP-异柠檬酸脱氢酶有两种： （1）细胞质中的不受柠檬酸抑制 （2）线粒体中受生理浓度柠檬酸抑制。 一旦柠檬酸积累到一定水平，