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用IMAGEJ的图形叠加功能改进免疫组化染色的方法 时间：2009年11月22日16:05 来源：中国医药导报 李晓霞1，杨国强2* 　　（1.郑州市儿童医院，河南郑州?? 450003；2.郑州人民医院， 河南郑州?? 450003） 　　[摘要] IMAGEJ是一个共享的医学图形分析软件，它具有很强的图形操作和分析的功能。利用它的图形叠加功能可以很方便的把免疫荧光图像和组化染色图像叠加在一起。对于同一张涂片先进行某种分子的免疫荧光染色得到它在不同细胞中的分布图，再进行组化染色得到细胞的染色图，然后进行图像叠加。既可以清楚地观察细胞结构，也明确了这种分子在不同细胞中的分布。改进简化了常规免疫组化的操作步骤，利用荧光检测也提高了检测的敏感度，为细胞内分子的定量化检测打下了基础。 　　[关键词] IMAGEJ医学图形分析软件；图形叠加；免疫组化；定量分析 　　[中图分类号]? R446.61?????????????????? [文献标识码] B????????????? [文章编号]?? 1673-7210（2009）11（c）-128-01 　　本文介绍用IMAGEJ的图形叠加功能改进免疫组化染色的方法如下： 　　1 方法 　　第一，下载IMAGEJ。打开网址HTTP：//RSB.INFO.NIH.GOV/IJ点击DOWNLOAD。可以看到不同版本的下载方式。根据自己计算机的配置情况选择合适的下载方式，一般是选取WINDOWS方式下载。 　　第二，经解压缩后，打开压缩包内的文件，然后按照提示完成IMAGEJ的安装。 　　第三，取一张骨髓涂片，4%甲醛固定5 min。滴加山羊血清封闭液，室温下10 min后甩去多余液体，不洗。滴加单克隆小鼠抗人CD3。37℃下1 h后用PBS洗3次，每次2 min。滴加荧光标记的山羊抗小鼠IgG，37℃下20 min后PBS洗4次，每次5 min。在荧光显微镜下观察，并存取文件1。 　　第四，用瑞氏染色液复染，镜下观察存取得到文件2。 　　第五，打开IMAGEJ和文件1文件2。利用THRESHOLD和Brightness/Contrast命令调整亮度和对比度，SUBTRACT BACKGROUND剪除背景，存取文件3。 　　第六，使用IMAGE CALCULATE命令叠加文件1和文件3，这样荧光图像和瑞氏染色图像就叠加在了一起。 　　2 讨论 　　计算机生物医学图像分析不仅大大延伸了人眼的分辨能力，而且还可以超越时间和空间的限制，把实际工作中较困难的操作利用其虚拟功能转变为其他简单的形式来完成，从而引起一些实际工作从原理到实际操作的根本的改变[1]。 　　如上述方法进行的淋巴细胞的亚群分析，从操作上不同于传统的最常用的两种方法：免疫荧光方法和免疫酶方法。而是经过改进在计算机的辅助下既利用了免疫荧光的高灵敏度，又弥补了它不能观察细胞结构的不足。传统的免疫酶法也具有较高的敏感度且经过复染也可以观察细胞结构，但与免疫荧光法进行比较，免疫酶法相对要复杂很多[2]。从根本上说这是因为荧光素是一种分子量很小的物质，可以很多分子同时直接标记在抗体上成为一种敏感度很高的显示系统；而免疫酶要成为一种理想的显示系统，必须借助于生物素-卵白素等一些中介分子的帮助，聚集够一定的含量，才可以在较短的时间内催化底物显色以达到足够的敏感度。因此免疫荧光法要简单很多，用免疫荧光法比较容易获得试验结果。但也有其缺陷就是细胞的结构不如经过染色看得清楚，它只能以明和暗区分是否是阳性细胞，即只能判断有或无，或进行简单的计数。利用免疫酶法复染后，不同细胞的结构则可以看得很清楚，这也是其优势所在，尤其在组织切片的免疫组化是不可缺少的；免疫荧光则达不到这种效果，借助于计算机的图像分析功能可以克服这一弱点。只需要再对同一切片进行复染，然后叠加染色图片和荧光图片。这样阳性细胞在切片中的分布以及整个组织结构都看得很清楚。同时，具体的操作步骤也简单了很多。 　　图像处理的功能远不止于此[3-4]。一帧待处理的计算机图像各像素有256个灰度等级，而人的眼睛只能分辨15～25个灰度等级，有些试验结果如用光学显微镜观察，并不能发现试验组与对照组之间的差异，而用图像分析系统测定灰度，再经统计分析，则可发现显著性差异。IMAGEJ可以进行灰度处理，图像滤波，直方图均衡，数学运算，伪彩色标记，图像放大，缩小等各种各样的图像操作[5]，并可进行图像的灰度值，阳性细胞的面积、直径、数量、分布频度等各种参数的测量。 　　IMAGEJ是NIH image开发的共享图像操作程序，可以在线和离线使用，可以显示、编辑、分析、操作、保存、打印８位、１６位和３２位图。支持包括：Tiff、Gif、Jpeg、Bmp、Dicom Fits和raw