原位杂交步骤-自己整理的1.doc

荧光原位杂交 试剂及其配制方法（以下试剂均需用RNase-free水配制）： 1×PBS：NaCl 8g∕L、KCl 0.2 g∕L、Na2HPO4 1.44 g∕L、 KH2PO4 0.24 g∕L，溶于DEPC处理的去离子水中，用pH计测其pH，再用NaOH调其pH为7.4； PBST：PBS加0.1%吐温-20； LiCI：配4M LiCI 100ml需要LiCI．H20 25.6g，配好后加入千分之一的DEPC，37℃，12h放置，高温灭菌。 4%多聚甲醛（4%PFA）： 准确称取40g多聚甲醛，溶于1000ml的1×PBS中，避光于摇床（37℃，160r∕m）上，待其全部溶解后，用棕色瓶分装成小体积包装，保存于－20℃。（注：本方法与其他一些文献用NaOH和HCl先后调节pH而促其溶解的方法略有不同，因是考虑到pH的稳定性；另外之所以采用上述方法使多聚甲醛缓慢溶解而没有采用文献中提及的用NaOH调节其pH至10促其溶解后再用HCl调节pH的原因，除了用一般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外，也因为不能用pH计对其酸碱度进行测量，因为它会损坏pH计）。取以上各成分，溶于DEPC处理过一定量的纯水（或双蒸水）中，测定其pH(放置一段时间待其pH稳定后)，据此以HCl或NaOH来调节其pH值至7.4，定容至所要求的体积。 （注：根据实际情况，因DEPC处理过的水其pH会下降，故本实验中实际上是用1mol∕L的NaOH来调节其pH）。 75%甲醇／PBST：将无水甲醇按75%（V／V）比例溶于PBST； 50%甲醇／PBST：将无水甲醇按50%（V／V）比例溶于PBST； 25%甲醇／PBST：将无水甲醇按25%（V／V）比例溶于PBST； HYB－溶液：50%甲酰胺（V／V）、5×SSC（终浓度）、0.1%吐温-20（终浓度）、RNase-free水（－20℃）pH6.2 HYB＋溶液：HYB－溶液、500ug／ml酵母tRNA、50ug／ml（终浓度）肝素，（－20℃）；pH6.2 50%甲酰胺／2×SSCT： 50%甲酰胺（V／V），2×SSCT（终浓度）； 2×SSCT：2×SSCT（终浓度），0.1%吐温-20； MAB马来酸缓冲液（Maleic acid buffer）：100mM maleic acid，150mM NaCl，pH 7.5(20℃)，溶于双蒸水，用浓缩或固体的NaOH调节pH为7.5，并过滤除菌（sterile） MABT:MAB，使用前加入0.1%吐温-20； 10×Blocking reagent（阻断剂）：将阻断试剂（Blocking reagent）溶于马来酸缓冲液中，摇晃并在加热器或微波炉上加热，使其终浓度为10％（w/v）；此储存液（原液）需高温除菌？（is autoclaved）并分装后保存于－20℃。 封闭缓冲液（blocking buffer）：10%羊血清、2%阻断剂（终浓度），两者溶于MABT；三者MABT:羊血清：10%阻断剂=7:1:2；也有用：1×PBT，2% sheep serum (vol/vol)，2 mg／ml BSA） 蛋白酶K储液：10mg／ml；将蛋白酶K按10mg／ml溶于PBT中，分装成100ul的小包装，保存于－20℃。使用浓度为10ug／ml。（注：PBS不需要除酶，因为蛋白酶K可以降解RNase） 抗地高辛荧光素偶联的抗体（Anti-digoxigenin-fluorescein，Fab fragments）保存及使用方法： 1、 激发最大波长（Excitation max）:494nm；发射最大波长（Emission ：523nm max） 抗体冷冻干粉末，用1ml双蒸水进行溶解，其终浓度为200ug／ml，即200ng／ul。注意事项：此保存液应该在使用前不久进行稀释，（Note: The stock solution should be diluted shortly before use）； 2、 以上保存液在2－8℃避光条件下，可以保存2个月。保存液应 避免反复冻融，分装后，保存于－20℃ 3、 推荐使用含0.5%BSA（w／v）的PBS（pH7.4）对以上抗体保存 液进行稀释； 4、 此抗体可以用来对地高辛标记的复合物进行检测，注意事项： 在使用抗体之前，10000rpm离心5min，且在液面吸取需要的体积。 探针的制备过程： 1、 设计上下游引物，加酶切位点（HindⅢ、EcoRⅠ）和保护性碱 基（3个保护性碱基），用来扩增目的基因片段，回收目的基因片段，然后用HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切。 2、 用限制性内切酶（HindⅢ、EcoRⅠ）对载体pSPT18（约1ug 的量）进行双酶切，琼脂