8第八章重组体的筛选.ppt

蓝白菌落 实验步骤 bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237 A B C M 5、酶切电泳筛选法 原 理 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度） 用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果。 A B A或B 不同克隆的酶切结果 筛选过程 第二节 免疫化学与核酸分析法 利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式： 一、放射性抗体检测法 1. 抗体与产物的结合方式 对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 125I 标记的二 抗结合蛋白 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 125I标记的二抗 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 固相支持滤膜 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 125I 标记的二抗 结合蛋白 125I标记的二抗 * * 第八章 重组体的筛选检测 一、核酸分子的遗传学与物理检测法 二、免疫化学与核酸序列分析法 将目的DNA片段与载体连接形成重组子，然后通过各种方法将重组子导入宿主细胞，得到所需要的带有重组DNA的转化子，这是基因工程的目的所在。 转化子：导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。 重组子的鉴定可以从直接和间接两个方面分析，可以从DNA、RNA和蛋白质三个不同水平进行鉴定。 重组子的筛选 直接筛选 间接筛选 DNA鉴定 载体筛选 翻译产物 转录产物 其他方法 （报告基因等） Northern blotting Western blotting 标记补救筛选 质粒载体的α互补筛选（蓝白色斑筛选法） 噬菌体包装容量的正性筛选 质粒载体的抗性标记筛选 同源性分析鉴定（原位杂交） DNA序列分析 重组子酶切图谱鉴定 重组子大小鉴定 一、遗传学检测法 1、根据载体表型特征的筛选 （1）抗药性标记插入失活筛选法 第一节 核酸分子的遗传学与物理检测法 克隆Kan抗性基因 （2）β -半乳糖苷酶显色反应筛选法 蓝白菌落 筛选白色菌落 2、根据插入基因遗传性状的筛选 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞之后，如果插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表达，而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补，那么就可以利用营养突变株进行筛选。 合成某一aa的基因 载体 酶切 连接 重组 缺少该aa合成酶基因的菌株 转化 只缺少该aa的基本培养基 筛选 重组子 生长、获得 二、核酸分子的物理检测法 原理： 碱基配对 杂交双方： 待测的核酸序列 插入片段基因制备的DNA或RNA探针 核酸杂交方法： 菌落印迹原位（in situ）杂交 斑点（dot）印迹杂交 Southern印迹杂交 都是通过一定的物理方法将菌落（噬菌斑）或突起的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同液体中的探针进行杂交。 1、菌落印迹原位杂交 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。 特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态 实验步骤 Smad2 mRNA在系膜增生型IgA肾病肾小球的表达 原位杂交×200 肺腺癌β-cat mRNA 原位杂交法×400 2、斑点印迹杂交 ★斑点印迹杂交与菌落原位杂交的原理相同 ★将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上 ★优点：简单、快速、可同时检测多个样品 ★常用于病毒核酸的定量检测 RNA或DNA 变性 NC膜 固定 杂交 放射自显影 检测 实验原理与步骤 提取 碱溶液 点样 加热 放射性探针 一定条件 X-底片 显影、定影 标记斑点 3、Southern 印迹杂交 ★1975年，英国Southern创建 ★ DNA与DNA的杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针