平板菌落的辨别计数和细菌染色.doc

环工综合实验 平板菌落的辨别计数和细菌染色 实验报告 环境科学与工程学院实验中心 实验题目 平板菌落的辨别计数和细菌染色 实验类别 综合 实 验 室 实 验 时 间 实验环境 温度: 湿度: 同组人数 一、 实验目的 1.学习平板菌落计数的基本原理和方法 2.掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术； 3.了解简单染色法的原理，并掌握其操作方法。 4.学习并掌握微生物涂片、革兰氏染色的基本技术和无菌操作技术 二、 实验仪器及设备 活材料：培养的菌落 染色液和试剂：结晶紫、碘液、95%酒精、沙黄 、蒸馏水 器材：废液缸、洗瓶、载玻片、盖玻片、接种环、煤气灯、擦镜纸、显微镜 三、实验原理 实验原理问答题： 1.如何对微生物菌落进行鉴别？ 答： 细菌：湿润，粘稠，易挑起，一般形成较小的圆形菌落，颜色有白色、黄色等，表面光滑或不光滑 放线菌：干燥，多皱，难挑起，菌落较小，多有色素，菌落背面有同心圆形纹路。这点可以和细菌菌落区分。 酵母菌：湿润，粘稠，易挑起，表面光华，比细菌的菌落大而厚，菌落为淡黄色，光滑，半透明，比细菌菌落大。 霉菌：菌丝细长，菌落疏松，成绒毛状、蜘蛛网状、棉絮状，菌落大型，肉眼可见许多毛状物，棕色、青色等，可见黑色的分生孢子群。 2. 如何通过对平板微生物菌落进行计数知道湖水、自来水和空气中细菌的数量？ 答：选择平均菌落数在30～300间的平板 ⑴若只有一个稀释度符合，以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告 ⑵若有两个稀释度符合，取决于二者比值（高稀释度的菌落数除以低稀释度的菌落数的值）：若0.5≤比值≤2，以两稀释度的菌落数乘稀释倍数所得的值的均值报告；若2≤比值或比值≤ 0.5，则取其中较少的菌落总数进行报告。 ⑶所有菌落数均不在30～300间以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数:若所有稀释度的菌落平均数均大于300，则按稀释倍数最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告;若所有稀释度的菌落平均数均小于30，则按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告。 空气中细菌含量的测定:X=100×100×N／(πr2) X—每m3空气中的细菌数；N：平板暴露5min，置37℃培养24h后生长的菌落数；r：平皿底半径（cm） 3. 微生物的染色机理是什么？（单染和革兰氏染色） 答：⑴简单染色法：所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子：带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫、碱性复红、番红（又称沙黄）等。细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。 ⑵革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（初染液）；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是沙黄。 四、实验步骤 1.对培养的平板菌落（湖水、自来水、空气）进行计数并辨别菌落形态。 2.革兰氏染色： （1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴蒸馏水，按无菌操作法挑取菌落，调匀并涂成薄膜，涂片必须均匀。 （2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 （3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，