β-内酰胺酶的检测.docxVIP

β-内酰胺酶的检测定义：β-内酰胺酶是一群酶是细菌对β-内酰胺酶类抗生素耐药的主要作用机制，它可以水解药物的β-内酰胺环使酰胺键断裂而失去抗菌活性，其水解效率是细菌耐药性的主要决定因子。现比较常用的是根据Ambler分子结构分A、B、C、D四类，其中A、C、D是以丝氨酸为酶的活性作用位点，而B类以金属锌离子为活性作用位点。具体分类见下表：功能分类（Bush）结构分类（Ambler）名称抑制特性代表酶克拉维酸EDTA1C头孢菌素酶--AmpC、MIR-12aA青霉素酶+-PCI、LEN-12bA广谱酶+-TEM-1,2、SHV-12beA超广谱酶（ESBLs）+TEM-3～29、SHV-2～62brA耐酶抑制剂广谱酶（IRTs）+/--TEM30-36、TRC-12cA羧苄酶+-PSE1,3,4、CARB-22dD氯唑西林酶+/--OOXA-1～11、PSE-22eA头孢菌素酶+-Cxase、L22fA非金属碳青霉烯酶+-IMI-1、NMC-A、Sme－13B金属酶-+L1、IMP-14青霉素酶--SAR-2检测方法：2.1 微生物活性消失法此法是以一株对青霉素高度敏感的枯草芽胞杆菌的指示菌，如待检菌株产生β内酰胺酶，破坏了青霉素，则在划线两边有枯草芽胞菌生长，否则指示菌仍呈很大抑菌环。具体操作结果解释参照《微生物学和微生物学检验》第115页，刘恭植主编，人民卫生出版社，1988年。2.2 淀粉-碘测定法β内酰胺酶破坏β内酰胺环，碘与被打开β内酰胺环结合，使蓝色的淀粉-碘复合物转变成无色。方法：用pH6.0磷酸缓冲液配制青霉素悬液 6000μg/ml，取该液0.1 ml置于微量稀释板凹孔中，挑选检测菌株数个菌落混悬于其中，摇动30min，静置室温中1h，加淀粉液2滴，再加碘液1滴，混合，立即观察颜色变化，阳性者当加入碘液后，首先立即出现蓝色、如在10min内消失蓝色，提示该菌产生β-内酰胺酶。2.3 酸测量法青霉素被β-内酶胺酶水解后成青霉素酸，pH值下降6.8以下，用酚红指示剂，由红(紫)色(原液：枸橼酸缓冲液pH8.5)→黄色(pH6.8以下)。2.4 头孢硝基噻吩显色反应头孢硝基噻吩(Nitrocefin)的β-内酰胺环被β-内酰胺酶打开，基质由黄色变成红色。液体方法：10mg头孢硝基噻吩溶解于lml的二甲基亚砜中，然后用0.1mol/L PBS(pH7.0)再稀释 1：20，最后浓度为500μg／m1，溶液呈黄或淡橙色，保存4～10℃，可用几个星期。取该溶液0.05ml置放于微量稀释板凹孔中或小试管中，挑取被试菌落，制成浓厚悬液，与凹孔中基质液混和，室温10～ 30min，头孢硝基噻吩由黄变成红色为阳性，若显色不明显，观察可延长6h。有报道纸片法用于流感嗜血杆菌和淋病奈瑟菌检测β-内酰胺酶的结果是准确的，但对于某些菌株产生少量而与菌细胞紧密结合的β-内酰胺酶，如腐生葡萄球菌等，用液体法检测更好。上述任何一种检测方法都应用质量控制。2.5 双纸片协同试验本法主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)革兰阴性杆菌的纸片扩散试验。方法为：把适量的菌液均匀涂布在MH平板上，在平板中央贴上含酶抑制剂的复合制剂如阿莫西林/克拉维酸纸片，在距它周围25mm处分别贴上第三代头孢菌素和氨曲南等药敏纸片作为指示药敏纸片，35℃孵育16－18h后观察结果。若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大的现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶（见图）。2.6 ESBLs确证试验当通过筛选试验后，对头孢泊肟、头孢他啶（10μg/片）抑菌圈≤22mm或氨曲南、头孢噻肟（30μg/片）≤27mm的菌株经头孢他啶（30μg/片）、头孢他啶/克拉维酸（30/10μg）;头孢噻肟（30μg/片）、头孢噻肟/克拉维酸（30/10μg）两组确证试验，其结果为两组中任何一组药物加克拉维酸与不加克拉维酸的抑菌圈相比，增大值≥5mm时判断为产ESBL菌株。也可以使用专用的ESBLs的E试条进行ESBL的表型确证试验，读取专用的ESBLs的E试条两端的MIC值，如头孢他啶与头孢他啶/克拉维酸的MIC比值≥8，判定为ESBLs阳性菌株，否则为阴性。3、临床意义:在革兰阳性菌种，金葡菌中的β-内酰胺酶一直较少发生进化。在革兰阴性菌中，TEM-1和SHV-1分别是大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中最重要和最多见的酶。属于Bush分类2b组，由质粒介导，可有效地水解青霉素和窄谱头孢菌素，随着三代头孢菌素的临床应用，加快了TEM-01和SHV-1酶的突变，形成各种超广谱β-内酰胺酶（ESBLs），介导了细菌对青霉素和一、二、三代头孢菌素以及单环菌素耐药，但对头霉素、碳青霉烯及酶抑制剂敏感。近年发现非TEM和SHV起源的CTX-M系列ESBL，他们对头孢噻肟水解力强