弧菌属的鉴定.docxVIP

弧菌属的鉴定1、标本要求： 1.1 尽量用药前采集标本。1.2 粪便：病人留取粪便510g，霍乱弧菌患者取“米泔样”便送检。1.3 脓性分泌物及其它无菌体液：用无菌瓶直接送检。血标本不要冷冻。1.4 不可接受的标本：干的拭子、蜡盒、未消毒容器、破裂的瓶子、标本泄漏、标本无标签。2、仪器35℃孵箱、普通光学显微镜3、试剂碱性蛋白胨水、麦康凯平皿、硝酸盐培养管、1％盐酸四甲基对苯二胺水溶液、枸橼酸盐培养管、氨基酸脱羧培养管（1％NaCl）、氧化发酵(O-F)培养管、糖醇发酵管、湖南长沙天地人弧菌鉴定板。4、试验方法及原理：4.1、氧化酶用法：将滤纸片在1％盐酸四甲基对苯二胺水溶液中浸泡约1min，印刮平板上的菌落。结果观察：10s内观察颜色变化，变红－紫黑色为阳性，不变为阴性。4.2 Hugh-Leifson氧化发酵(O-F)培养管用法：用针挑取可疑菌落穿刺接种于两支O-F培养管中，其中一支滴加无菌石蜡油，高度不少于1cm。35℃培养过夜。结果观察：两支培养管均无变化为产碱型或者不分解糖型；两支培养管均产酸为发酵型；若不加石蜡的培养管产酸为氧化型。可以借此试验与非发酵菌区分开。4.3 枸橼酸盐试验(Simmons法)方法：将待检菌接种于枸橼酸盐培养基中，孵育过夜，观察结果。结果：有细菌生长培养基变蓝色为阳性，无颜色改变为阴性。4.4 氨基酸脱羧试验（1％NaCl）方法：取待检菌接种于氨基酸脱羧培养管（1％NaCl）和对照管中，封石腊油，35℃培养过夜，观察结果。结果：培养基变紫色为阳性，黄色为阴性。对照管应保持黄色。注意点：（1）．培养基的pH值很重要，弧菌要求在管内加入1％NaCl。（2）．加封石腊油造成厌氧环境。因为在厌氧情况下氨基酸脱羧生成的胺才稳定。（3）．对照管如不呈黄色，则氨基酸脱羧酶试验不能作出判定4.5 糖、醇发酵试验方法：接种待检菌于糖醇发酵管，35℃孵育过夜，观察。结果：培养基变红色为阳性，不变色或黄色为阴性。5、常规鉴定过程：5.1形态与染色：本菌属是一类菌体短小、弯曲成弧形或直杆状的革兰阴性细菌。大多数菌株具有一端单一鞭毛，运动迅速。其中霍乱弧菌呈弧形或逗点状，在病人“米泔样”便中，可呈头尾相接的“鱼群”样排列。作悬滴观察时，因细菌一端有鞭毛，就呈“穿梭”样运动。少数菌株有荚膜。5.2培养特性：兼性厌氧，利用葡萄糖，营养要求不高，但是许多菌株生长需要2％－3％的氯化钠（霍乱弧菌可以在普通培养基上生长），具有嗜碱性,最适生长温度为30－37℃。初次分离培养要求使用碱性蛋白胨水，因为这样可以抑制其它杂菌生长，在碱性蛋白胨水中经35℃培养增菌4－6h后可在液体表面大量繁殖形成菌膜。常用的选择培养基有硫代硫酸钠－枸橼酸盐－胆盐－蔗糖琼脂平板（TCBS）。从腹泻的病人中分离到的副溶血性弧菌在含高盐（7％）的人O型血或兔血及以甘露醇为碳源的我妻（wagatsuma）琼脂培养基上产生β－溶血现象，称为神奈川现象（KP）。5.3生化反应及鉴定要点：5.3.1 属间鉴定：弧菌属归弧菌科。同科中还有气单胞菌属和邻单胞菌属，均为氧化酶阳性，发酵型。弧菌属与其两者的区别可依嗜盐性、甘露醇、氨基酸及Ο/129(2,4-二氨基-6,7-二异丙基碟啶)敏感性等加以区别，参见下表1。Ο/129试验用纸片浓度10μg、150μg二种，与纸片法药敏试验相同，出现抑菌环即判阳性(S)。表1: 弧菌科3个菌属特性的鉴别特 性气单胞菌属邻单胞菌属弧菌属甘露醇+-+鸟氨酸-++精氨酸++-嗜盐性--+Ο/129敏感RSS5.3.2 属内鉴定：本菌属包括共36个种，其中与临床相关有12种，鉴定中用0％NaCI生长、氧化酶、硝酸盐、氨基酸及发酵肌醇等几个试验将上述12个菌种分成6个群（见表2）。分群后，仅1群、5群和6群还需要继续区分，具体鉴定见表3。表2: 弧菌属的分群鉴定试 验1群2群3群4群5群6群霍乱弧菌拟态弧菌麦氏弧菌辛辛那提弧菌霍利斯弧菌海鱼弧菌河弧菌弗尼斯弧菌溶藻弧菌副溶血弧菌致伤弧菌沙鱼弧菌0％NaCl中生长++----------1％NaCl中生长++++++++++++氧化酶-+++++++++硝酸盐-+++++++++精氨酸+-+++----赖氨酸-++++鸟氨酸-肌醇---+--------表3: 致病弧菌的生化特性(阳性百分率)试 验霍乱弧菌拟态弧菌麦氏弧菌霍利斯弧菌海鱼弧菌河弧菌弗尼斯弧菌溶藻弧菌副溶血弧菌致伤弧菌辛辛那提弧菌沙鱼弧菌精氨酸(1％NaCl)00600959310000000赖氨酸(1％NaCl)991003505000991009957100鸟氨酸(1％NaCl)99990000050955500葡萄糖产气000010010000000麦芽糖99991000100100100100991001