cDNA-AFLP技术的原理及其在基因表达研究中的应用.doc

cDNA-AFLP技术的原理及其在基因表达研究中的应用 摘要：cDNA-AFLP是一种新的研究基因表达的技术，具有重复性好、稳定、可靠的特点，可对生物体转录组进行全面、系统的分析。本文简单介绍了cDNA-AFLP的基本原理和技术特点，并对其在构建转录连锁图、与EST序列的互相转化、基因表达特性研究及分离特异表达基因等方面的应用进行了概述。 关键词：cDNA-AFLP 基因表达 指纹技术 基因组研究的发展过程分为两部分：前期的结构基因组学（structural genomics）和后期的功能基因组学(functional genomics)。结构基因组学以建立生物体高分辨率遗传图谱、物理图谱和大规模基因组测序为主；功能基因组学是利用结构基因组学提供的数据信息系统研究基因功能，以高通量、大规模实验方法及统计与计算机分析为特征[1]。功能基因组学的一个重要方面即是研究转录组（transcriptome），探讨基因组在特定时期转录水平上的表达丰度及差异表达等情况，大规模分析基因的表达模式，为研究基因组的功能提供重要信息。目前已经有多种分析基因表达水平及差异表达基因筛选的方法：Northern杂交、消减杂交（subtractive hybridization）、差示筛选(differential screening)、mRNA差别显示（different display）、微阵列分析（microarray）、基因表达序列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）[2] 及cDNA-AFLP（cDNA amplified fragment length polymorphism）。其中杂交法、差示筛选和mRNA差别显示只适合于高丰度或表达差异大的基因筛选，且由于在筛选基因方面的随机性使之无法描述转录组的全貌。SAGE、微阵列和cDNA-AFLP则可对生物体转录组进行大规模全面、系统的分析。cDNA-AFLP技术是Bachem等人[3] 以AFLP 为基础发明的用于RNA指纹分析的方法。由于PCR反应中采用较高的退火温度，反应条件严谨，可靠性高，重复性好，且不需要预先知道序列信息，所需仪器设备简单，相对于SAGE和微阵列而言，可更广泛应用于生物体基因表达特性的研究。 1 cDNA-AFLP技术的基本原理和实验流程 cDNA-AFLP技术结合了RT-PCR和AFLP技术，其基本原理：以纯化的mRNA为模板，反转录合成cDNA。用识别序列分别为6-bp和4-bp的两种限制性内切酶酶切双链cDNA，酶切片段与人工接头连接后，利用与接头序列互补的引物进行预扩增和选择性扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳显示[4,5,6]。 cDNA-AFLP的实验流程大致可分为四步（图1）：（1）模板的制备和cDNA的合成；（2）双链cDNA片段的酶切和人工接头的连接；（3）酶切片段的预扩增和选择性扩增；（4）凝胶电泳分析[4]。预扩增过程为选择性扩增提供了大量充足的模板。而且cDNA-AFLP所用的原始材料量极少，每份样品约100~200mg，因而可对小组织样品进行精确筛选[3]。用AFLP分析基因组DNA时，引物的3′端需用3个选择性碱基。cDNA相相对简单，引物3′末端用2个选择性碱基，约256个引物组合即可满足实验的需要。cDNA-AFLP扩增的片段大小在100bp~1000bp之间，平均每对引物约扩增50条谱带。因此，利用一对合适的内切酶组合和256对引物即可得到大约13000条带。 2 cDNA-AFLP的技术特点 2.1 选择合适的内切酶组合标准的cDNA-AFLP体系中，采用识别序列分别为6-bp和4-bp的双酶切组合。在基因组AFLP分析中，限制性内切酶的选择取决于基因组的复杂度和DNA的甲基化水平。分析cDNA时，内切酶的选择主要取决于切割的频率。理想的酶切组合是识别位点为6-bp的酶在每个cDNA样品中有一个酶切位点，而在其一边或两边有一个4-bp的酶切位点，酶切片段的大小在100bp~1000bp之间[3,4]。因此，内切酶的选择应最大限度覆盖mRNA池，且所选的酶切组合可同时进行酶切和接头的连接，减少酶切片段之间的互相连接造成的假象。因此，在选择内切酶时，充分利用已发表的cDNA序列进行分析，筛选最佳的内切酶是一条行之有效的途径。还可根据cDNA3′端和5′端非翻译区富含A、T的特性，选择识别序列的碱基组成集中在有义的cDNA区段的内切酶，实现有目的的选择扩增。据推测，植物基因组中大约可编码16000至33000个基因[7,8]。若选择合适的酶切组合进行分析，几乎所有的表达基因包括信息量极低的基因均可用cDNA-AFLP检测。Bachem 等人[3] 利用AseI和TaqI酶切马铃薯块茎形成过